Az izocitrát-dehidrogenáz (ICDH) és az izocitrát-liáz (ICL) hatása a carbon fluxus szétválasztására az izocitrát csomópontnál E. coli acetáton történő növekedése esetén (esettanulmány)

Az izocitrát-dehidrogenáz (ICDH) és az izocitrát-liáz (ICL) hatása a carbon fluxus szétválasztására az izocitrát csomópontnál E. coli acetáton történő

növekedése esetén (esettanulmány)

Készítette: Füleki Lilla

Miről is lesz szó?

• Acetáton való növekedése során az E. colinak szüksége van a glioxalát ciklusra is kiegészítőként bioszintetikus prekurzorok előállítására.

Közvetlen verseny a glioxalát-ciklus izocitrát enzime (ICL) és a Krebs-ciklus izocitrát dehidrogenáz enzime (ICDH) között.

• Izocitrátra: affinitásICDH > affinitásICL, de: magas

intracelluláris izocitrát koncentráció+az ICDH részleges inaktiválásáva az ICL-nek és MS-nak (malát-szintetáz) kedvez (bár nem találták még meg azt az in vivo

szignált, ami felerősíti a glioxalát utat, és az is biztos, hogy nem az acetát az (El-Mansi 1998).

V1

V2 V6

V7

V4 V5

V8

V3

• Walsh és Koshland (1984): mennyiségileg meghatározta a két ág carbon fluxus arányát az izocitrát csomópontnál

(radioaktívan jelölt izotópos vizsgálat+NMR spektroszkópia)

• Cél: ICDH, ICL, (MS) enzimek relatív hozzájárulásának meghatározása a carbon fluxus átlagos elosztáshoz a kp-i metabolizmus különböző enzimei között.

• MetaModel szoftvercsomaggal meghatározták:

-steady-state fluxusokat és a különböző metabolitok koncentrációit

-elasztikus koefficiensek mátrixát

-kontroll és válasz koefficiensek különböző steady-state-ek alatt

• Adatok elemzése: Kacser’s MCA teóriája és a sebességmeghatározó lépés koncepció alapján.

A modell

 MetaModel 2.1 (Cornish-Bowden és Hofmeyr 1991) szoftver: az összes változó változását képes mérni és szimulálni; és ennek

alapján kalkulálni a fluxus, metabolit koncentráció és koefficiens változásokat.

 A metabolit koncentráció változásokat differenciál egyenletek írják le:

-Összesen 8 különböző reakció: ezek közül a 6. és a 7. átalakulási sebességei az ICL és MS lineáris kapcsolata miatt azonosak.

-Steady-state állapotban a változás mértéke minden metabolitnál 0, azaz a képződési sebesség nettó értéke megegyezik a fogyasztás ütemével.

-A ciklusban vannak ún. metabolit-poolok: melyek 3 különböző reakcióban is részt vehetnek.

A skeleton modell egyensúlyi egyenletei

Egyensúlyi egyenlet Flux kapcsolatok

0=V1-V2-V6 (izocitrát) >V1=V2+V6 0= V2-V4-V3 (L-

ketoglutarát) >V2=V3+V4 >V3=V2-V4 0= V4+V6-V5

(szukcinát) >V5=V4+V6 >V4=V5-V6

0=V6-V7 (glioxalát) >V6=V7 0=V5+V7-V8-V1 (oxál

acetát) >V1+V8=V5+V7 >V8=V5-V2

Az enzimatikus reakciók felírásának alapjául egy Michaelis-Menten típusú egyenlet szolgált:

v=(V_fS/K_s-V_rP/K_p)/(1+S/K_s+P/K_p)

ahol:

•V_f és V_r : V_max értékek az oda- és visszafelé játszódó reakciókban

•S: szubsztrát

•P: termék

•K_s, K_p: Michaelis-Menten konstansok (vagyis adott metabolitra vett K_m értékek)

• Az egyenletek végigkövetik a változás mértékét és az összes szubsztrát koncentráció változását az acetil-CoA belépését követően.

• Figyelembe veszik az ICDH és ICL eltérő aktivitását.

Walsh és Koshland (1984): az ICDH reverzibilis inaktiválása a fluxus 1/3-nak az ICL-on keresztüli áramlását eredményezi (vagyis 2,6:1-hez az ICDH javára) ezért 0,388 a modellben az ICL(E6) koncentráció, míg a többi enzimé 1.

Illetve az acetil-KoA, glutamát és a PEP (mint “külső”

metabolitok) intracelluláris koncentrációi: 56; 1,06; 1,69

mM-nak lettek rögzítve ezek mutatják, hogy az E.

coli 1 gramm biomassza szárazanyag bioszintéziséhez ilyen bemeneti acetil-KoA és ilyen kimeneti glutmát és oxálacetát mennyiség szükséges (El-Mansi és mtsai 1994).

Enzim Sebesség Metabolitok (mM) Sebesség [E₁]=1,0000 1,1117 [x]=56,0000 (Ac-KoA input) rögzített

[E₂] =1,0000 0,8008 [OAA]=0,2236 változó

[E₃] =1,0000 0,0468 [ISO]=0,1174 változó

[E₄] =1,0000 0,7540 [KET]=0,1551 változó

[E₅] =1,0000 1,0469 [Y]=1,0600 (GLU output) rögzített [E₆]=0,3880 (ICL) 0,3109 [SUC]=0,3880 változó

[E₇] =1,0000 0,3109 [GLY]=0,0322 változó

[E₈] =1,0000 0,2642 [Z]=1,6900 (PEP output) rögzített

(A sebességek mmolelfogyasztott szubsztrát /perc/ 10 ml sejttérfogat-ban kifejezve.)

Eredmények I.

7.5 ábra:

 Ahogy az ICDH-n keresztüli carbon fluxus lecsökkent az izocitrát intracelluláris koncentrációja megemelkedett olyan szintre, ami fenntartja az ICL-n keresztüli fluxust (annak gyengébb affinitása ellenére).

 A további adatok azt mutatták, hogy bármilyen csökkenés az ICDH koncentrációjában a carbon fluxus ICL-en (és MS-en) keresztüli megnövekedését eredményezi. Ez feltölti elsődleges köztitermékekkel és bioszintetikus prekurzorokkal a központi anyagcsereutat.

 Az ICDH-n keresztüli fluxus hatással van a központi anyagcsere út többi enzimjére is:

 Az összegzési tétel alapján (Kacser és Burns 1973) az enzimek fluxus kontroll koefficienseinek összege (J_ICDH-ra) 1.

 Ismétlés:

fluxus kontroll koefficiens: adott anyagcsereút adott enzimén keresztüli fluxus relatív változásának mértéke válaszul az enzim (saját)koncentrációjának kis mértékű változására.

elaszticitás koefficiens: a szubsztrát vagy az adott ko-faktor koncentrációjának kis mértékű változásából adódó relatív

fluxus változás mértéke.

1

1

 

 n i

J

C

ICDH

ICDH ICL

ICL MS

MS

 A fluxus kontroll koefficiens:

-Rendszerjellemző

-Értéke nem teljesen független az anyagcsereút többi enzimétől.

-A többi enzim fluxus kontroll koefficiens értékeivel való kapcsolatot az összegző tétel adja meg.

-Az elaszticitási koefficienssel való kapcsolatát a konnektivitási tétel írja le ami figyelembe veszi a kinetikai tulajdonságait az összes anyagcsereútban résztvevő enzimnek.

• Válasz koefficiens: a externális effektorok hatása a metabolikus fluxusra.

• Nagy mértékben függ az enzim elaszticitási és a fluxus kontroll koefficienseitől (az effektorra vonatkozóan). Hogy az effektor a fluxusra hatni tudjon, ezen értékeknek elég magasnak kell lennie.

Eredmények II.

7.4, 7.5, 7.6 ábrák:

 Az ICDH koncentrációjának 1 fölötti növekedése már sem az enzimen keresztüli fluxust, sem az enzim fluxus kontroll koefficiensét nem növeli.

 Másrészt bármilyen csökkenés a ICDH intracelluláris

aktivitásában jelentős hatással van az enzim carbon fluxusára és fluxus kontroll koefficiensére.

 Vagyis: ha az ICDH aktivitását 20%-ra, vagy annál kisebbre csökkentjük, az ICDH fluxus kontroll koefficiense növekszik (és ez az enzim carbon fluxusában is látszódik).

 Tehát az ICDH-n keresztüli fluxus acetáton való növekedéskor meghaladja a celluláris igényeket, így nem lehet sebesség-

meghatározó.

7.7 ábra

 ICL aktivitásának közvetlen változtatása az enzimkoncentráció szisztematikus növelésével

egy bizonyos küszöbértéket elérve a 2 ciklus összehangoltan működik, és többé nem gond a fluxus megoszlása ICL és ICDH között.

• Ha növeljük ICL koncentrációját: az ICDH-n és az ICL-n keresztüli fluxus is nőni kezd az intracelluláris izocitrát koncentráció rovására (ami csak 0,271 mM-ig emelkedik).

• Ha 100-ra növeljük az ICL koncentrációt: ICDH-n keresztüli carbon fluxus 115 mmol/min, ICL pedig 378 mmol/min-re emelkedik.

Összefoglalás:

 Az ICDH koncentráció növelése egy vad-típusban megfigyelt küszöbérték felett nem jár együtt ICDH-n keresztüli fluxus növekedéssel sem önmagában, sem az egész központi

anyagcsereút esetén. Csak az izocitrát pool kimerülését okozza, és így csökkenti a glioxalát úton keresztüli fluxust.

 Általánosságban: Egyetlenegy enzim aktivitásának

fokozása/koncentráció növelése nem megfelelő megoldás arra, hogy egy adott anyagcsereutat felerősítsünk,

produktivitását növeljük.(De ez nem vonatkozik katalitikus aktivitás csökkentésre!)

 Egy, az anyagcsereútban minden enzimet aktiváló effektor koncentrációjának növelése észlelhető növekedés okoz a fluxusban (és a hozamban) főleg akkor, ha az érintett

enzimek relatív magas fluxus kontroll koefficienssel rendelkeznek.

 E. coli acetáton való növekedése során az ICL-n keresztüli fluxus esszenciális. (nem csak kipótolja a központi

anyagcsereutat prekurzorokkal, hanem fenntartja a magas intracelluláris izocitrát koncentrációt)

 Egy bizonyos ICL koncentráció küszöbérték felett a Krebs ciklus és a glioxalát mellékút összehangoltan működik.

Kérdések:

1. Mi az ICDH, ICL és az MS? Milyen kapcsolat áll fent az ICDH és az ICL között?

2. Mi az a MetaModel?

3. Az enzimatikus reakciók felírásának alapjául szolgáló Michaelis- Menten típusú egyenlet

4. Mi történik, ha növeljük az ICL aktivitását?

5. Mi a következménye az ICDH koncentráció emelésének?

6. Mit mutat meg az elaszticitási koefficiens és a fluxus kontroll koefficiens?

7. Mitől függ a válasz koefficiens értéke, és hogyan?

8. Mi történik, ha ICDH aktivitását 20%-ra, illetve az alá visszük?

9. Hogyan hat egy effektor a hozamra?

10. Mit állapíthatunk meg végeredményben az ICL-en keresztüli fluxusról, illetve a glioxalát anyagcsereútról?

Köszönöm a figyelmet!