Kiroptikai spektroszkópia

(1)

Kiroptikai spektroszkópia

(2)

Bevezető

• A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt.

– Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon),

– ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében)

– CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz

függvényében)

• Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a

(3)

Optikailag aktív, királis anyag

• Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták

összefüggésbe).

– Arago, kvarckristály (1811)

– Biot, borkősav vizes oldat (1838)

– Pasteur, aszimmetria – optikai aktivitás (1848-53)

– Kekulé (1856-1863), Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom

• Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak

egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir -

(4)

Enantiomerek (1)

• Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk;

„ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak).

• Szimmetrikus környezetben:

azonos fizikai és kémiai tulajdonságok

• Aszimmetrikus környezetben:

Királis molekulák egymáshoz való viszonya

(5)

Enantiomerek (2)

• Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum.

• A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül:

– Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik – Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl.

diasztereomer képzés, rezolválás alapja)

– „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön

• (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút

(6)

Kiralitás fajtái

C COOH

CH₃ NH₂ H

Centrális kiralitás Vonal kiralitás

O

OH OH OH

HO OH

O

OH OH OH

HO OH

CHO

HO H

H OH

HO H

CH₂OH

(7)

A fény polarizációja

Az elektromágneses

sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek

kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált.

x y

z

Nem polarizált fény

Síkban

polarizált fény

(8)

Síkban polarizált fény előállítása

Polarizálatlan fény

A vertikálisan polarizált komponens átjut.

A horizontálisan

A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely

hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).

(9)

A lineárisan polarizált fény két

cirkuláris komponense

(10)

Optikai forgatás

• A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve.

• n_bal≠njobb

• Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át.

• n=c/v

• Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel).

(11)

Optikai forgatás (2)

(12)

Polarimetria: Az optikai forgatás adott

hullámhosszon /589nm (Na D- vonal)/

(13)

Optikai forgatás

• Általában specifikus forgatásként van megadva [], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva).

• Megadása: []_D25= +65° (c=1.0, EtOH)

• +, óramutató járásával megegyező irány

• – , óramutató járásával ellentétes

• Tisztaság meghatározás:

– Mért specifikus forgatás*100 specifikus forgatás (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

(14)

Optikai rotációs diszperzió (ORD)

• Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében)

Polikromatikus fényforrás

Detektor:

fotoelektron sokszorozó

(15)

ORD spektrum

• Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés).

A csúcs és a vályú közti metszéspont hullámhossza jól egyezik az abszorpciós

_max –al..

(16)

Cirkuláris dikroizmus

(17)

Cirkuláris dikroizmus (2)

• A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) különböző mértékben nyelődik el (abszorbeálódik) királis mintán áthaladva.

bal

jobb

A

A 

(18)

CD spektrum

• A CD spektrumban A-t,

-t (egyezményesen _bal-

jobb) tüntetik fel a

hullámhossz függvényében.

(néha az ellipticitást (), a moláris ellipticitást [])

• A_balA_jobb A /c·l

• (A=A_bal-A_jobb)

A A_jobb

A_bal

(19)

Enantiomerek CD spektruma

 _jobb,(R)= _bal,(S),  _bal,(R)= _jobb,(S)

 _{bal, (R)}- _jobb,(R) = _(R)=  _{jobb, (S)}- _bal,(S)=  _(S)

 _{bal, (S)}- _jobb,(S)= _(S)=  _{jobb, (R)}- _bal,(R)= _(R)

TÜKÖRKÉPI VISZONY

(20)

CD mérés (spektropolariméter)

Minta (királis)

Detektor: Fotoelektron sokszorozó

LS (light source) M (mirror),

S (slit), P (prism), SH (shutter)

(21)

• Ahol az

optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus.

• Ahol az anyag nem nyel el:

UV, ORD, CD

összefüggése

(22)

A CD spektroszkópia alkalmazásai

• Enantiomertisztaság meghatározás

• Abszolút konfiguráció meghatározás

• Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés

tanulmányozása).

• Fehérjék tanulmányozása: másodlagos

(23)

Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás

• Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság).

• A racém részen felüli túlsúly.

100

 R  S ee

(24)

Enantiomertisztaság meghatározás CD (koncentráció független)

• Anizotrópia-faktor (g-faktor):

– A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása.

– Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.



 

 



 

 

l c

l c A

faktor A a

anizotrópi :

(25)

Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?]

• Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba.

• Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak.

• Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a

nemkívánt hatásokért felelős

(26)

Racémként hozták forgalomba

• A tájékoztató szerint jól használható köhögés,

pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén

nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a

hányingert is csillapítja.

• Célcsoport: állapotos nők.

• Feltűnően sok gyermek

született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg

Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide)

(27)

• (R)-izomer (S)-izomer

(28)

Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása

• Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R):

bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor.

• Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító.

• Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus

artritis (izületi gyulladás) ellen –

(29)

Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei

• (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetű vegyület.

• (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály)

• (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és

ennek összevetése a mért spektrummal.

(30)

Példa (1)

O O

H H

(2R,3S)

(-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció

O O H O O H

H

CH₃

Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció

(31)

Oktáns szabály

(ketonokra) (2)

• Adott molekula- geometriához

meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül

észlelhető n→π*

elektronátmeneté hez tartozó CD

O

x

y

z O

Amely

térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv.

(32)

Oktáns-szabály alkalmazása (2)

(+) (-) Az atomok túlnyomó

része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez

negatív karbonil sáv tartozik.

(33)

Oktáns-szabály alkalmazása (2)

11b 2 stabil konformációban létezik, az egyikre

(+)

(-)

(34)

Oktáns-szabály alkalmazása (2)

Pozitív Cotton effektus = Pozitív CD jel

Negatív Cotton effektus = Negatív CD jel

(35)

Indukált CD

• Királis gazdamolekula vagy kötőhely

(ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS)

• Akirális, kromofór vendégmolekula

(színezékmolekula, hatóanyagmolekula).

• A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet

vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az

e

^-

átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának

(36)

Indukált CD

cisz-parinársav (kromofór,

akirális vendégmolekula) -laktoglobulin

(királis host, látható tartományban nincs elnyelése)

(37)

Indukált CD

2 db akirális festékmolekula

kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún.

exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula

kötödik egy

fehérjekötőhelyen).

Egyre több

festékmolekulát

hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált

(38)

Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata

• Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás

• CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait.

• A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok,

(39)

Másodlagos szerkezet

• Fehérjék esetében a távoli UV tartományban

(180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet.

• 190-240 nm közt a CD spektrum az amid

csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet,

(40)

Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma

-hélix

rendezetlen

szerkezet -redő

-turn

(41)

Lineárkombináció

-hélix

-redő



^^⁽^⁾



^ ^_



^^_ ⁽^⁾



^ ^_



^^_ ⁽^⁾



^ ^_r



^^_r⁽^⁾



Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

(42)

Illesztés

Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék.

(Programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak).

(43)

Eredmény

Másodlagos szerkezetek

A mért CD spektrum alapján

megkapjuk a vizsgált

proteint alkotó másodlagos szerkezetek százalékos arányát.

(44)

-hélix -hélix rendezetlen szerkezet

-redő

•Mivel a három alap

konformáció (-hélix, -redő, rendezetlen szerkezet) CD spektruma igen különbözik

egymástól, kis, lokális konformációs változások is

szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban.

(45)

A ribonukleáz hődenaturációja

• Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on.

-30 20

-20 -10 0 10

184 200 220 240 250

CD

Wavelength[nm]

-12 -5

-10 -8 -6

10 20 40 60 80

CD

Temperature[C]

-hélix

rendezetlen szerkezet

(46)

Köszönöm a figyelmet!