Szövetminták és mikrodializátumok vizsgálata

A szövetmintákból történő D- és L-aminosav meghatározás során fiatal, 2, 4, 8 és 62 napos csirkékből, valamint felnőtt, 100-150 napos nőstény patkányokból, valamint egerekből származó agyszöveteket használtunk, míg a mikrodializátumokat 2 napos csirkékből nyertük.

5.3.1 D-szerin és D-aszpartát meghatározása C57BL/6 egerekből

A D-szerin, mint NMDA receptor ko-agonista a glicin kötőhelyhez kötődik nagy affinitással. Méréseink során egér agymintákból határoztunk meg D-szerin mennyiségeket. Azokon az agyterületeken mértünk nagyobb D-szerin mennyiségeket, melyek kiemelten fontosak a neuroplaszticitásban, a memóriaformációban és a tanulási folyamatokban felnőtt állatoknál [111, 123, 145] (15. ábra). A kisagyban található alacsony D-szerin koncentráció összhangban van az irodalomban találtakkal, amit a nagy cerebelláris DAAO jelenlétével magyaráznak. DAAO enzim kiütött mutáns egereknél magas D-szerin szintet mértek a kisagyban is. Megfigyelhető volt továbbá az NMDA receptorok mennyiségi növekedése is a knock-out egereknél [119, 120], ami alátámasztja az előbbi feltevést. A vizsgálat során a mutáns és a vad típusú egerek között semmilyen különbséget nem találtak egyéb fiziológiás paramétereiket tekintve.

Az újonnan fejlesztett, validált módszerünk célja, hogy megfelelően pontosan, egyidejűleg tudjuk mérni biológiai mintákban a D-szerin és D-aszpartát mennyiségének változását. Az irodalom áttekintése során számos szerző számolt be D-szerin meghatározásról biológiai mintákból. Fajtól és agyterülettől függően 7-340 nmol/g koncentrációban mértek D-szerint. Eredményeink nagyságrendileg hasonló tartományba esnek (11-50 nmol/g), mint az irodalomban található adatok. A D-aszpartát vizsgálata során jelentős korspecifikus eltérést találtunk a fiatal és a felnőtt egerek közt (14. ábra).

A fiatal egereken közel egy nagyságrenddel nagyobb mennyiségben található meg a D-aszpartát, mint a felnőtt egyedekben, agyterülettől függetlenül, mely szintén összhangban van az irodalmi adatokkal [21].

81

5.3.2 Aszpartát és glutamát enantiomerek vizsgálata szöveti extraktumból, valamint mikrodializátumból

Korábbi méréseink során a biológiai közegben nem sikerült D-glutamátot kimutatnunk.

Az aminosavak meghatározására alkalmas módszereink a szabad aminosav mennyiséget mérik, ugyanis a mintaelőkészítés fehérjementesítéssel jár. Korábbi eredményeink [204]

alapján a striatumból az L-aszpartát és L-glutamát együttesen szabadul fel csirkék esetén és az excitátoros axonok végében mindkét neurotranszmitter megtalálható [1], mely állítás igaz patkányokra is [59].

Eredményeinkből következtetve a csirkéknél az L-glutamát és L-aszpartát nem mutatott korspecifikus változást, szemben a D-aszpartáttal. Az L-aminosavak szintje a 4. napon mutatkozott a legalacsonyabbnak, azonban a későbbiekben koncentrációjukat nagyrészt állandónak találtuk (16. ábra).

Három olyan agyterületet vizsgáltunk, mely részt vesz az imprinting mechanizmusban és a passzív elkerülési tesztben. Ez az iMM, az mSt és az arcopallium, melyeket együtt vizsgáltunk az emlősöknél ismert homológjaikkal (Ptctx, nucleus accumbens, amygdala). A cerebellum mindkét fajnál kontrollként szolgált. Eredményeink alapján nagyon robosztus korreláció figyelhető meg az mSt/nucleus accumbens régiók között, ahol is alacsonyabb L-glutamát szint figyelhető meg mindkét fajnál a többi agyterülethez viszonyítva (17. ábra). Az eredményeinket alátámasztja, hogy ezeken a területeken főleg GABAerg beidegzés található és sok excitátoros terminál, mely glutamát és aszpartát tartalmú, de glutamáterg és aszpartáterg perikaryon kevésbé jellemző.

Mérési eredményeink során 0,3-0,4 μmol/g koncentrációban találtunk D-aszpartátot két napos csirkék agyában, mely jól korrelál az irodalomban leírt értékkel (0,4 μmol/g) [122], amit 20 napos csirkeembrióból mértek [21]. A 36 órás újszülött patkányokhoz képest (0,1±0,022 μmol/g D-aszpartát [34]) nagyobb koncentrációban található meg a D-aszpartát két napos csirkéknél (17. A ábra). Az irodalomban leírtakhoz hasonló eredményeket kaptunk D-aszpartát mennyiségre patkány agyterületek vizsgálatakor is

82

[21, 22, 67, 208]. Zhao és mtsai méréseik során szintén kapilláris elektroforézis technikát alkalmaztak lézer-indukálta fluoreszcenciával D-aszpartát szint meghatározásához patkány cerebrumból (maximális érték 81 nmol/g szövet). A méréseik során szintén megfigyelhető volt a korfüggés. Prenatális patkányoknál mérték a legnagyobb koncentrációt, amely a korral haladva egyre inkább csökkent [208], mely eredmény nagyságrendileg szintén hasonló az általunk nyert eredményekkel. Egy 2011-es publikációban Han és mtsai HPLC-vel történő D-aszpartát meghatározása hat het2011-es patkányok agyából hasonló mennyiségeket mutatott ki, mint a mi módszerünk [58].

A csirkéken végzett passzív elkerülési teszt során nem találtunk szignifikáns különbséget a D-aszpartát szintekben azon agyterületeknél, melyek a memóriaképződésben szerepet játszatnak (mSt, iMM), illetve egyéb végagyi és végagy alatti régiókban sem (Arco, Cb) a 24 órás megfigyelés során. Egy lehetséges magyarázat erre, hogy a fiatal csirkék agyában nagy mennyiségben előforduló D-aszpartát szint nem függ a viselkedési ingerektől. Valószínűleg fontosabb szerepe van a tónusos ingerelésben, fenntartva így a szinaptikus plaszticitást a korai tanulási folyamatokhoz [168]. Feltehető, hogy a D-aszpartát extracellurás emelkedésének hiánya abból adódik, hogy maga a D-aszpartát nem egy azonnali jelátvivő molekula a viselkedési válaszoknál.

A mikrodialízis kísérletek során az ivás jutalmazó hatására, szemben az L-aminosavaknál tapasztalttal, nem sikerült szignifikáns D-aszpartát emlekedést kimutatnunk, addig kémiai depolarizáció hatására (magas KCl koncentrációjú dialízis puffer bejuttatása) jelentős D-aszpartát szint emelkedést mutatott a kontroll értékekhez képest. A kálium hatása, szemben az L-aszpartát és L-glutamátnál tapasztalt (szintén nagyon robosztus) extracelluláris koncentráció emelkedéssel, a D-aszpartát esetén sokkal elhúzódóbb (kb egy órán át tartó) felszabadulást eredményezett, mielőtt visszatért volna a kiindulási értékhez (18. ábra). Ennek magyarázata lehet valamilyen másodlagos mechanzimus, mely felelős a D-aszpartát folyamatos felszabadításáért a K⁺ gyors felszabadító hatása után. A kutatócsoportunk korábbi munkája során az L-aminosavak esetében tapasztalt [204], hirtelen történő nagymennyiségű felszabadulás a vezikuláris felszabadulásra jellemző, míg a D-aszpartát esetében egy sokkal összetettebb tárolási, valamint felszabadulási mechanizmust feltételezhető. Ennek egy

83

lehetséges bizonyítéka, hogy irodalomban leírásra került vezikuláris felszabadulása a D-aszpartátnak, azonban a vezikuláris gátlás hatására a D-aszpartát felszabadulásának teljes megszüntetése nem volt lehetséges. Felvételéért a glutamát-reuptake transzport fehérjék felelősek, melyek azonban a glia sejteken is megtalálhatóak [36]. Így felmerül, hogy a D-aszpartát egy része nem vezikulárisan, sőt nem neuronálisan szabadul fel, amint az a szerin esetében leírásra került (glia eredetű felszabadulás [145]). A D-aszpartát felszabadulása jelenleg is intenzív kutatások tárgyát képezi. Eredményeink alapján látható, hogy a szöveti D-aszpartát mennyisége közel két nagyságrenddel kisebb az L-aszpartáthoz képest, azonban az extracelluláris térbe meglepően nagy mennyiségű D-aszpartát szabadul fel. KCl hatására az extracelluláris térbe jutó összaszpartát mennyiségének egyharmadát teszi ki a enantiomer (5. táblázat). Az, hogy a D-aszpartát ilyen módon hogy képes hozzájárulni a szinaptikus plaszticitás kialakításához, még további vizsgálatokat igényel.

Összefoglalásként elmondható, hogy a szöveti koncentrációja a D-aszpartátnak jelentősen változik a csirkék életének első egy hetében agyterülettől függetlenül.

Csirkéknél a vizsgált periódus az ún. szenzitív szakasz lezáródása, mely a korai tanulást szolgálja (bevésődés (imprinting), nem megfelelő íz elkerülése stb.). A mikrodialízis eredményekből arra következtethetünk, hogy az aszpartát extracelluláris koncentrációjának egy jelentős mennyiségét a D-enantiomer teszi ki.

A fentebb ismertetett irodalmi eredmények és a módszereinkkel mért mennyiségek alapján kijelenthetjük, hogy a fejlesztett módszereink által kapott eredmények jó korrelációt mutatnak az irodalmi eredményekkel, amely validitásukat igazolja.

84