Detektálási módszerek

Az enantioszelektivitás abban az esetben nő, ha az egyes szelektorok hatására kialakuló mobilitás különbség azonos előjelű. A töltéssel nem rendelkező szelektorok esetén akkor érhetünk el növekedést az enantioszelektivitásban, ha minden szelektor azonos enantiomer felé rendelkezik nagyobb affinitással. Töltéssel rendelkező szelektorok esetében a komplexált forma mobilitása akár ellenkező irányú is lehet. Abban az esetben, ha több, töltéssel rendelkező szelektor van egyidejűleg jelen, csak akkor nő az enantioszelektivitás, ha az egyes szelektorok eltérő enantiomerek felé rendelkeznek nagyobb affinitással, és eltérő irányban befolyásolják az enantiomerek mobilitását. A töltéssel rendelkező szelektor ugyanakkor betölthet csupán szállító funkciót is. Ekkor nem szükséges enantioszelektivitással rendelkeznie [20, 102, 118, 172]. Kettő vagy több enantiomerpár egyidejű elválasztására gyakran használnak két királis szelektort tartalmazó rendszert [45, 103, 175]. Ekkor jellemzően az egyik szelektor az enantioszelektivitást, a másik a kémiai szelektivitást biztosítja [44, 80]. A gyakorlatban elterjedt a töltéssel rendelkező, illetve neutrális ciklodextrinek kombinációja [102].

1.5.3 Detektálási módszerek

A kapilláris elektroforézis többféle detektálási módra ad lehetőséget különböző előnyökkel és hátrányokkal. Az analitikus feladata a megfelelő detektálási mód kiválasztása az analitikai feladatnak megfelelően. A kapilláris elektroforézis sajátságai (kis mintamennyiség, detektor csatlakoztatása a kapillárishoz) miatt a megfelelő detektor megválasztása nem könnyű feladat. A detektálás lehet direkt és indirekt.

Indirekt detektálást abban az esetben lehet alkalmazni, ha a mérendő komponens nem rendelkezik detektálható tulajdonsággal. Ez esetben inverz módon a pufferhez képest kapott negatív csúcs jellemzi a koncentrációját e vegyületnek. A direkt meghatározás a vizsgálandó komponensek valamilyen detektálható tulajdonságából nyert kvantitatív információ alapján történik [133]. A legfontosabb technikák:

32

 Optikai detektálás (UV és fluoreszcens detektálás)

 Elektrokémiai detektálás

 Tömegspektrométer használata detektorként

Az optikai detektálás két legismertebb módja az UV detektálás, illetve a fluoreszcencia mérése. Az UV elnyelés során feltételezett, hogy az elválasztandó komponensek rendelkeznek kromofór csoporttal, mely a detektálás hullámhosszán elnyeléssel rendelkezik. Kapilláris elektroforézis alkalmazásakor előnyös, hogy a kapilláris anyaga az elválasztást nem zavarja, azonban a flexibilitást biztosítő külső poliimid réteget el kell távolítani a detektorablaknál, amely a kapilláris sérülékenységét nagyban növeli. Az UV elnyelés a legszélesebb körben használt detektálási mód, azonban alacsony koncentrációérzékenysége korlátozza a használatát kapilláris elektroforézis során.

Speciális technikákkal növelhető az UV detektálás érzékenysége (buborék cella, Z-cella). E speciális technikákkal azonban a megnövekedett átmérő zónakiszélesedéshez, így a csúcsok torzulásához vezethet. A leggyakoribb forrása a deutérium lámpa. Az UV mérések szelektivitását növeli, ha nagyobb hullámhosszon történik a mérés. Ez azonban csak akkor megvalósítható, ha a vizsgálandó komponensek rendelkeznek nagyobb hullámhosszon is elnyelő kromofór csoporttal. Minél kisebb hullámhosszt használnak a detektáláshoz, annál nagyobb lesz a háttér puffer UV-elnyelése is, mely zavarja a mintakomponensek meghatározását. Némelyik puffer csak kifejezetten alacsony hullámhosszon rendelkezik elnyeléssel, ezért méréstervezéskor a puffer minőségét, illetve elnyelési tulajdonságát (ún. cut-off hullámhosszát) is figyelembe kell venni [127]. Az UV detektorok közül a legmodernebbek a diódasoros (ún. PDA) detektorok.

Ezesetben a detekor nem csak meghatározott hullámhosszon/hullámhosszakon méri meg a detektorablak előtt elhaladó vegyületek abszorbanciáját, hanem egy adott hullámhossz tartományban készít felvételt, így az elválasztás során idő, intenzitás és hullámhossz görbéket kapunk, mely a módszerfejlesztés szempontjából nagyon lényeges információkat szolgáltat [81].

A fluoreszcens detektálás a legszelektívebb detektálási forma, ami használatos kapilláris elektroforézis során, mellyel az érzékenység általában egy-két nagyságrenddel növelhető az UV detektáláshoz képest. Fluoreszcens folyamatok során egy fluorofór

33

(fluoreszcenciát mutató molekula) alapállapotú π vagy nemkötő elektronja egy adott hullámhosszú foton elnyelése következtében gerjesztődik (excitáció), amely során egy magasabb energiaállapotú π*-lazítópályára kerül. A gerjesztett állapotból az alapállapotba való visszatérés történhet foton kibocsájtás (emisszió), vagy egyéb, nem sugárzással járó folyamatok során. Az emisszióval járó folyamatok arányának jellemzésére a kvantumhatásfokot (Φf), míg a fluorofór gerjeszthetőségére a moláris abszorptivitást (ε) használjuk. Fontos követelmény a gyakorlatban alkalmazott fluorofórokkal szemben, hogy magas kvantumhatásfokkal és moláris abszorptivitással, valamint kellő fotostabilitással rendelkezzenek. A fluoreszcencia detektálás használatának korlátja, hogy csak fluoreszcens molekulák mérésére használható. Ritka kivétel, ha az elválasztandó vegyületek natív fluoreszcenciával rendelkeznek, ezért általában felhasználása során a vizsgálandó vegyületből származékképzéssel állítják elő a már fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkező molekulát (lásd következő fejezet). A fluoreszcens detektálás során a megfelelő gerjesztőforrást általában lézerfénnyel biztosítják, mely az érzékenységet nagyon megnöveli. A lézerfény előnye, hogy egy adott hullámhosszon szelektíven képes gerjeszteni. A legnagyobb hátrányuk, hogy drágák, valamint csak egy adott hullámhosszon tudnak általában gerjeszteni [152].

Biológiai minták kapilláris elektroforézissel történő vizsgálata során érzékenysége és szelektivitása révén a lézer-indukálta fluoreszcencia (LIF) az egyik leggyakrabban alkalmazott detektálási mód [130, 171]. Az LIF során a leggyakrabban használt lézerforrások:

 Ar-ion lézer (488/520 nm)

 He-Cd lézer (325/442 nm)

 Diódalézerek (különböző hullámhossz)

Az amperometriás, illetve a vezetőképességen alapuló módszerek az optikai úton történő detektálás alternatívái lehetnek. Ezen módszerekkel ugyanakkor nem érhető el jelentős érzékenységbeli javulás, megfelelő kivitelezésük viszont speciális elektronikai egységet és módosított kapillárist igényel.

34

A kapilláris elektroforézis tömegspektrométerrel történő összekapcsolása lehetőséget teremt az elválasztott vegyületek szerkezetének tanulmányozására. A rendkívül alacsony injektált mintatérfogat miatt azonban ez a detektálási mód alig haladja meg az UV-elnyelésen alapuló módszer érzékenységét. További problémát jelent a két berendezés megfelelő csatolása, az alkalmazható segédanyagok és pufferek szűk köre pedig megnehezíti a módszerfejlesztést. Fehérjék és biomolekulák analízise során értékes szerkezeti információkat szolgáltat, ezért alkalmazása főleg ezen a területen gyakori [20].