Stimulált humán neutrofilek, mieloperoxidáz enzimük segítségével, szuperoxid

Az enkefalinok az endokrin és az idegrendszer fontos neurotranszmitterei/neurohormonjai.

folyamatokban, ahol többek közt a fehérvérsejtek termelik őket^49-52. Mindkét peptidnek a fájdalomcsillapító hatásában nélkülözhetetlen az N-terminális Tyr aminosav, mert ezen keresztül kötődnek a receptoraikhoz⁵³. Elsődleges inaktiválódási/lebomlási mechanizmusuk is a Tyr vesztésen keresztül zajlik^{54, 55}. Ahogy azt az előző fejezetben ismertettem ezen peptidek Tyr-fenoxil szabadgyök-származékai effektíven reagálnak szuperoxiddal, ami a Tyr aminosav szerkezetét jelentősen módosítja 1. séma). Alapvető kérdés, hogy stimulált humán neutrofilek, az általuk generált szuperoxid, H2O2 és mieloperoxidáz (MPO) enzim segítségével, oxidálják-e az enkefalin származékok Tyr aminosav komponenseit.^C4

A neutrofil fagocita fehérvérsejtek a veleszületett immunitás alapelemei. Elsősorban fagocitózis útján pusztítják a betolakodó patogén mikroorganizmusokat és meghatározó szerepük van a gyulladásos folyamatokban is⁵⁶. Ezekben a folyamatokban kulcsszerep jut az általuk generált ROS-oknak^{6, 9}. A membránjukban található NADPH oxidáz (Nox 2) enzimkomplex, stimulus hatására nagy mennyiségű szuperoxidot generál a fagozómás és/vagy a sejten kívüli térben. A szuperoxid dizmutációjának következtében képződik H2O2, ami az azurofil granulumokban tárolt, de stimulus következtében szintén a fagozómás és sejten kívüli térbe kibocsájtott, MPO segítségével a jelenlévő (pszeudo)halogenideket (leginkább a Cl^, Br^, SCN^) (pszeudo)hipohalogénessavakká (HOCl, HOBr, HOSCN) oxidálja⁵⁷. Az MPO enzim reakcióinak kinetikája meglehetősen bonyolult (további részletek a 4.3.2 fejezetben olvashatók), de két alapvető kinetikai ciklust elkülöníthetünk: A már említett hipohalogéneket termelő halogenációs és a gyökös reakcióutakon végbemenő peroxidáz ciklusokat (3. séma).⁵⁸

3. séma A mieloperoxidáz enzim két összefüggő katalitikus ciklusa. Az ún. peroxidáz és halogenációs aktivitásokért egy- és kételektronos folyamatok sorozata felelős. A halogenációs ciklus első lépésében a H2O2, a natív Fe^III-at tartalmazó fehérjét Fe^IV-oxo szabadgyök kationná (Compound I) oxidálja egy kételektronos oxidációs lépésben. A

halogenációs ciklus záró lépésében a Compound I-es forma reagál a halogenidekkel vagy a tiocianáttal hipo(pszeudo)halogenitek képződése közben. A Compound I, megfelelő szubsztrát jelenlétében (pl Tyr) két egymást követő egyelektronos redoxireakciókban is redukálódhat szubsztrát szabadgyökök képződése közben. Ez utóbbi peroxidáz ciklus első egyelektronos lépésében köztitermékként képződik az ábrán látható Compound II-es enzimforma.^C31

A HRP-hez hasonlóan (3. reakció) az MPO peroxidáz ciklusa felelős a Tyr (és egyéb fenol származékok) egyelektronos oxidációjáért³⁶. Szemben a HRP szabadon hozzáférhető aktív centrumával az MPO hem-csoportja egy oldószertől elzártabb kötőzsebben helyezkedik el.

Ennek ellenére azt találtuk, hogy az MPO -még fiziológiás mennyiségű kloridion jelenlétében is (ami a peroxidáz és halogenációs ciklusok versenyét eredményezi)- effektíven generál fenoxilgyököket nemcsak a szabad tirozinon és kisméretű dipeptidek tirozinjain, hanem az enkefalin és az endomorfin peptideken is (9. ábra).

9. ábra Tyr-tartalmú peptidek, mint peroxidáz-szubsztrátok összehasonlítása. A peptideket MPO és HRP enzimek szubsztrátjaiként alkalmaztuk, a reakciókat spektrofluorimetriásan követtük, a dimerképződésen keresztül. (A) A dimerképződés steady-state sebességeinek összehasonlítása (ld. betét ábra a (B) panelen). A kezdeti sebességek a Tyr-MPO reakcióban mért sebességekhez viszonyított relatív, %-ban megadott értékek. (B) Leu-Enk dimerizációjának reprezentatív kinetikai görbéje kloridionok távollétében és jelenlétében. Betét ábra: A kinetikai görbék lineáris szakasza. ^C4

Ha izolált humán neutrofilokat enkefalinok jelenlétében forbol-mirisztát-acetáttal (PMA) aktiváltunk, akkor a bekövetkező enkefalin oxidáció főtermékei a monoxid és a dioxid származékok voltak (10. ábra).

10. ábra Aktivált humán neutrofilok által termelt tirozintartalmú peptidek monoxid- és dioxid származékainak detektálása LC/MS módszerrel. A PMA-val aktivált neutrofilok által oxidált 200 μM (A) Leu-Enk, és (B) Met-Enk LC/MS kromatogramjai. A kromatogramok lentről fölfelé a natív peptidekhez illetve a mono- és dioxidszármazékokhoz tartoznak. A termékek mennyiségét a prekurzor ion mennyiségéhez képest számított relatív csúcs alatti területben fejeztük ki (olyan referencia rendszerben, ahol az MPO gátolt, így nincs reakció).^C4

Tömegspektrometriás szerkezetvizsgálataink rámutattak, hogy a Leu-Enk dioxid a biciklusos Tyr-OOH-származék, a monoxid pedig ennek a redukált Tyr-OH formája. A Met-Enk esetében a dioxid az előző fejezetben leírt 2. sémán bemutatott modell alapján képződő a Tyr-OH szulfoxid terméknek felel meg. Az enzimatikus reakciókkal ellentétben aktivált neutrofilok nagy mennyiségű Enk monoxidot is generáltak, ami kizárólag a Met-szulfoxid származéknak felelt meg, és ahogy azt később látni fogjuk ez a rendszerben képződő HOCl Met-Enk-el való reakciójának a terméke. Összhangban az enzimatikus rendszerekkel a dioxidszármazékok keletkezéséhez elengedhetetlenül szükséges volt a neutrofilok aktiválása, aktív MPO jelenléte illetve H2O2 és szuperoxid is (11. ábra). SOD jelenlétében a dioxid képződése gátolt, ezért ditirozin nagyobb mennyiségben képződik az 1. reakciónak megfelelően, ahogyan azt az enzimatikus rendszernél is tapasztaltuk (lásd 1.A.

ábra).

11. ábra Különböző kezelések hatása a (A) Leu-Enk és (B) Met-Enk oxidációs termékek képződése aktivált humán neutrofilok jelenlétében. A neutrofilokat PMA-val stimuláltuk, a reakciókat 30 perc után 20 μg/ml kataláz enzim hozzáadásával állítottuk le. A Met-Enk-dioxid, Met-Enk-szulfoxid, Leu-Enk-hidroperoxid és Leu-Enk monoxid termékek képződését LC-MS, a dimer termékekét spektrufluorimetriás módszerrel követtük. Az adatpontok és hibáik n = 3-4 független, különböző vérből mért eredmények átlaga és szórása.

*P0.0001, statisztikailag szignifikáns különbség a párosított t-teszt alapján.^C4

Mindezen észlelések fényében, összhangban az enzimatikus rendszereknél javasolt modellel (1. séma), a dioxidok képződése az MPO katalizálta enkefalin H2O2-dal való oxidációján keresztül a képződő Tyr-fenoxil szabadgyök és a NADPH oxidáz által generált szuperoxid addíciós reakciójában képződnek. A Met Enk esetén az intramolekuláris oxigén transzfer (2.

séma) eredményeképp képződik a Met-Enk-Tyr-OH-Met-szulfoxid származék. A relatíve nagy mennyiségben képződő Met-Enk-szulfoxid képződése (a dioxiddal ellentétben) gátolt volt a HOCl-reaktív metionin vagy humán szérum albumin jelenlétében, ami alátámasztja, hogy ez a származék valószínűleg a HOCl általi Met oxidáción keresztül képződik (12. ábra).

A termékek képződését a Met-Enk-koncentráció függvényében követve is jól látható, hogy a Met-Enk-dioxid és dimer képződések szuperoxid-függők (13.A,B. ábra). míg a Met-Enk- szulfoxid képződés nem (13. C. ábra). Érdekesség, hogy alacsonyabb MetEnk -koncentrációknál szuperoxid jelenlétében egy trioxidszármazék is képződik (13.E. ábra).

Tömegspektrometria és FOX analízis segítségével igazoltuk, hogy ez a Met-Enk-Tyr-OOH-Met-szulfoxid származék (14. ábra). Ennek a vegyületnek a képződése annak köszönhető, hogy a relatíve nagy mennyiségben termelt HOCl gyorsan oxidálja a jelen lévő Met-Enk tioéter csoportjait és (redukált metionint tartalmazó Met-Enk hiányában) az így képződő szulfoxid lesz az MPO elsődleges enkefalin szubsztrátja. A hidroperoxidcsoport hosszú élettartama itt azzal magyarázható, hogy mivel a Met-csoport a molekulában már oxidált formában van, az intramolekuláris oxigén transzfer reakció gátolt.

13. ábra Met-Enk neutrofilek által közvetített oxidációjának termékei a Met-Enk koncentrációjának függvényében. A Met-Enk koncentrációjának hatását vizsgáltuk az (A) dimer, (B) Enk-dioxid, (C) Enk-szulfoxid, (D) fennmaradó Enk és (E) Met-Enk-trioxid termékekre, SOD enzim jelenlétében (

□,

○,

folytonos vonal). Az adatpontok n = 3 független, különböző vérből mért eredmény átlagát reprezentálják.^C4

14. ábra Bal oldal: Met-Enk-S=O hidroperoxid képződés vizsgálata az MPO/XO/acetaldehid rendszer hatására (A) LC/MS vagy (B) FOX módszerrel. Jobb oldal: Met-Enk-trioxid tömegspektrometriás vizsgálata. (A) fragmentációs spektrum, (B) fő fragmensek, (C) Met-Enk-trioxid feltételezett szerkezete. A peptid fragmensek elnevezése a Roepstorff-Fohlman nevezéktan alapján történt.^C4

A neutrofilok fontos gyulladást serkentő szerepük mellett, enkefalinok kibocsátásán keresztül, a gyulladásos fájdalom enyhítésében is részt vesznek^{49, 59}. Továbbá fiziológiai körülmények között az enkefalinok a neutrofilok aktiválásában is szerepet játszhatnak^{60, 61}. Mindezek fényében eredményeink azt sugallják, hogy a gyulladás helyszínén az aktivált neutrofilok által kibocsátott MPO és ROS a fenti reakcióutakon az enkefalinok Tyr és Met aminosav komponenseit oxidálhatják. A keletkezett enkefalin származékokban a Tyr aromás jellege és N-terminális amincsoportja elvész. Annak ellenére, hogy a Met oxidáció nem befolyásolja a Met-Enk fájdalomcsillapító hatását⁶², az N-terminális Tyr amincsoport

4.1.3 Normál enzimműködés közben képződő fehérje-Tyr szabadgyökök reakciója