4.2 Cisztein tiolok redoxibiokémiája C7-C25, B1, B2
4.2.3 Cisztein reakciói (pszeudo) hipohalogénessavakkal
A cisztein aminosav HOCl-val való reakciója nagyon gyorsC8. 1H-NMR spektroszkópia segítségével tisztáztuk, hogy nagy Cys felesleg mellett a reakció végterméke széles pH tartományban CySSCy. A Cys:HOX arány emelésével megjelentek a nagyobb oxidációs számú ként tartalmazó CySO2H és CySO3H származékok is. Cáfoltuk azonban, hogy a reakcióban hosszú élettartamú szulfenil-klorid származék képződik. Igazoltuk, hogy a szulfenil-kloridnak hitt köztitermék valójában a reakcióelegyek tökéletlen keverésének köszönhetően megváltozott koncentrációarányok miatt képződő cisztin-diklóramin molekula volt. Ez a származék a CySSCy HOCl-val való reakciójával képződik (lásd később).
Stopped-flow módszerrel szisztematikusan vizsgáltuk a HOCl és Cys aminosav reakcióinak kinetikáját. A sebességi egyenlet koncentráció- és pH-függésének analízisével igazoltuk, hogy a protonált HOCl forma 4 nagyságrenddel gyorsabban reagál, mint a deprotonált OCl (kHOCl = 1,2 × 109 M1s1, kOCl = 1,9 × 105 M1s1). Megkíséreltük megmérni a Cys reakcióinak sebességét HOBr-val illetve OBr-nal is, de a HOBr lényegesen nagyobb savi disszociációs állandója miatt a reakció sebessége még 14-es pH-n (1 M koncentrációjú NaOH-ban) is túl gyors ahhoz, hogy stopped-flow módszerrel mérhető legyen. Ez az eredmény arra utal, hogy a HOBr és a Cys reakció sebessége közelít a diffúziókontrollált küszöbhöz.
Részletesen tanulmányoztuk a HOSCN GSH-nal és a nagy moláris abszorbanciájú modell tiol 5-tio-2-nitrobenzoesavval (TNB) való reakcióinak a kinetikáját is, Ismereteink szerint ez volt az első a HOSCN tiol-specifikus reakcióira vonatkozó kinetikai tanulmány.
A TNB HOSCN-val való reakciójának harang alakú pH-függését, termékanalízist, a TNB savi disszociációs állandóinak meghatározását, a polikromatikusan gyűjtött adatok SVD
analízisét és a sebességi egyenlet koncentrációfüggéseinek vizsgálatát követően a 28-32.
reakciókkal leírt modell alapján levezetett 33. egyenlettel illesztettük (40. ábra).
TNB−SH− TNB−S2−+H+ KaTNB(SH) (28)
H++OSCN− HOSCN 1
KaHOSCN
(29)
HOSCN+TNB−S2− k→ 10TNB−S−SCN−+OH− (30)
HOSCN+TNB−SH−k→ 13TNB−S−SCN−+H2O (31)
TNB−S−SCN−+TNB−S2−gyors→ DTNB2−+SCN− (32)
Azokkal a feltételezésekkel élve, miszerint a 28. és 29. reakciók gyors előegyensúlynak tekinthetők és a 32. reakció relatíve gyors, a 33. egyenletnek megfelelő sebességi egyenlet vezethető le a 28-32. reakciókkal leírt modell alapján.
−d[OSCN−]
dt = (k10KaTNB(SH) +k13[H+]) × 1
(KaHOSNC+ [H+]) 1
(KaTNB(SH) + [H+])× [HOSCN]tot[TNB]tot[H+]
(33)
A 28-33. egyenleteket a Nagy és társszerzői 2009-es közleményC15 tartalmazza.
40. ábra A pH hatása a HOSCN/OSCN és TNB közötti reakció sebességére. (A) A mért pszeudo-elsőrendű sebességi állandók változása a hidrogénion-koncentráció függvényében pH>6.5 esetén és a pontokra illesztett egyenes. (B) Felső panel: A reakció sebességének pH profilja. A folytonos vonalat az adatpontok 33. egyenlettel való illesztésével nyertük. Alsó panel: Számított részecskeeloszlás a pH függvényében. Jelölések: OSCN (folytonos vonal), HOSCN (rövid szaggatott vonal), a TNB teljesen deprotonált (szaggatott vonal), egyszeresen protonált (pontozott vonal) és teljesen protonált (hosszú szaggatott vonal) formái.C15
A javasolt modell szerint a reakció széles pH tartományban (2,5 < pH < 8) kizárólag a HOSCN protonált formán keresztül zajlik. A TNB és a GSH HOSCN-val való bimolekuláris reakcióinak mért másodrendű sebességi állandói meglepően nagy értékek voltak: kTNB = 1,26 × 108 M1s1 és kGSH = 6 × 108 M1s1 és közel estek a HOCl és Cys közötti reakció állandójához (1,2 × 109 M1s1). Tehát a HOSCN pH = 7,4-en mért nagyságrendekkel lassabb reakciója tiolokkal (kGSHpH7.4 = 8 × 104 M1s1) a HOSCN HOCl-hoz és HOBr-HOCl-hoz képest lényegesen kisebb savi disszociációs állandójából adódik. A pH-függés illesztéséből újra meghatároztuk a HOSCN savi disszociációs állandóját: pKaHOSCN = 4,85 ± 0,01, ami az irodalmi pKaHOSCN = 5,3-as 77 értéktől jelentős eltérést mutat.
Véleményünk szerint az eltérés a korábbi munkában alkalmazott módszerek korlátaira vezethető vissza.
Ahogy már említettem, a HOCl és HOBr roncsoló biológiai hatásait elsősorban nem specifikus reakcióiknak tulajdonítják. A HOSCN biológiai szerepére vonatkozó eredmények irodalma korlátozott. Ennek ellenére ismeretes, hogy a HOCl és HOBr-nél sokkal kevésbé erélyes oxidálószer, és a fehérje aminosav komponensek közül a cisztein tiolokkal specifikusan reagál. Érintőleges vizsgálatokon nyugvó irodalmi adatok arra utaltak, hogy a
HOSCN kevésbé toxikus emlős sejtekre, mint a HOCl és HOBr. Ezt enyhébb reaktivitásával és tiol-specificitásával magyarázták78. Érdekes azonban megemlíteni, hogy endotél sejtekkel végzett kísérleteink arra utalnak, hogy a HOSCN a HOCl-val és a HOBr-val ellentétben, gátolja a programozott sejthalált (apoptózist) a kaszpáz enzimek inaktiválásán keresztül (a kaszpázok tiolcsoportjainak reverzibilis oxidációjával 41. és 42. ábra)C16. Ennek a biológiai jelentőségét még vizsgálni kell, de ez a megfigyelés utalhat arra, hogy a HOSCN specifikus tiolcsoportokat támadó tulajdonsága okozhat kóros elváltozásokat is a természetes sejthalál gátlásának következtében felhalmozódó sérült sejteknek köszönhetően.
41. ábra A HOSCN kaszpáz aktivitást csökkentő hatása in vitro kísérletekben. A lizátumok olyan sejtekből készültek, amelyeket előzőleg 7 órán át kezeltünk szérummentes médiummal az apoptózis kiváltására. Ezeket a lizátumokat a megadott mennyiségű HOSCN-el kezHOSCN-eltük 1 percig, majd meghatároztuk a kaszpáz aktivitást DTT távollétében és jelenlétében. Az eredményeket %-os értékben fejeztük ki, a 100% a kezeletlen lizátumhoz tartozik. Üres oszlopok: 0 mM DTT, sávozott oszlopok: 5 mM DTT (n=3).C16
kaszpáz 3 ellenes antitestekkel. (A nyíl a hasított kaszpáz 3 sávját jelzi; negatív kontroll (-ve), kezeletlen sejtek; pozitív kontroll, apoptózis indukálására SFM-ben inkubált sejtek, n=3). Annak meghatározására, hogy a HOSCN képes-e gátolni a kaszpáz 3-at apoptózis indukálása után, HUVEC sejteket 5 órán át kezeltünk szérummentes médiummal majd ezt követően 2 órán át HOSCN-val (másodlagos kezelés). Felszedés után (C) meghatároztuk a kaszpáz 3 aktivitásukat DEVD-AMC segítségével vagy (D) vizsgáltuk a kaszpáz 3 hasadási fokát. Az SFM-mel előzetesen kezelt sejteknél (+ve) tapasztaltuk a kaszpáz 3 hasadását, de a HOSCN másodlagos kezelésnek kitett sejtek esetében nem. Az (A) és (C) esetben az eredmények és a hibasávok 4 párhumazos mérés átlagait illetve szórásait mutatják. *P0,05 statisztikailag szignifikáns különbség.C16