A dolgozatban leírt új +ssRNS vírusok sikeres azonosításának – kezdetben rajtunk kívül álló – véletlen módszertani oka volt: a primerek specificitása, azaz inkább aspecificitása.
Olyan adott vírusok genomrészeire specifikusnak hitt primerekkel (p289/p290, UNIV-kobu-R/UNIV-kobu-F, stb.) dolgoztunk, melyekrıl a használat során kiderült, hogy addig ismeretlen vírusok kimutatására is alkalmasak. Tulajdonképpen ennek a megfigyelésnek a tudatos használatával sikerült késıbb számos új állatfajban több, korábban nem ismert +ssRNS vírust azonosítani. Az elsı lépés a p289/p290 jelő általános calicivírus primer volt, mely a porcine kobuvírus (és egy új sertés astrovírus) kimutatásához vezetett. De ilyen a humán enterovírusok 5’UTR nem kódoló régiójára tervezett szőrı-primerpárunk (Non-human Enterovirus-5’UTR-R/F) is, mellyel a dicistronos RNS genomú vírust (Halastavi árva RNS vírus) sikerült kimutatni. De a legjobb példa erre az általunk ezt követıen a kobuvírusok konzervatív 3C/3D régiójára tervezett UNIV-kobu-R/UNIV-kobu-F primerpár, mely a kobuvírusok (Aichi, bovine kobuvírus, porcine kobuvírus) mellett a quail (fürj) picornavírus, a bovine hungarovírus, az ovine hungarovírus és az EV-C109 azonosítását is lehetıvé tette.
Ez a primer az eredeti szándékokkal ellentétben – bár kimutatja - kevésbé specifikus a kobuvírusokra, viszont jóval általánosabban használható picornavírusokra, akár új picornavírusok azonosítására is. Ráadásul, míg a p289/p290 primerpár esetén eltérı hosszúságú PCR-termékek keletkeznek calicivírusok és porcine kobuvírus esetén, az UNIV-kobu-R-UNIV-kobu-F primerek esetében a különbözı picornavírus nemzetségekbe tartozó picornavírus fajoknál a PCR-termék hosszúsága egyezik. Azaz a PCR-termék mérete alapján - szekvencia meghatározás nélkül - nem lehet megmondani, hogy milyen picornavírusról lehet szó. A háttérben a +ssRNS vírusok genetikai jellemzıi, ismert, illetve eddig nem ismert esszenciális konzervatív nukleotid motívumok húzódnak meg, melyek éppen azt bizonyítják, hogy érdemes e vírusokról komplexen gondolkodni. További, – jelenleg meghatározás alatt
levı - új vírusokat is sikerült e primerrel kimutatni, és elképzelhetı, hogy az UNIV-kobu-R-UNIV-kobu-F primerek használatával további új vírusok leírása történhet meg. Hasonlóan ehhez, a terveink szerint a parechovírusok és hungarovírusok feltárt közös, konzervatív 5’UTR IRES régiójára tervezett, az eltérı mérető PCR-termék alapján egyben diszkrimináló primerpár akár új, II-es típusú IRES-sel rendelkezı picornavírusok kimutatására is képes lehet.
A +ssRNS vírusok egy másik részét (nebovírus, porcine teschovírus, turkey gallivírus, ovine astrovírus, wild boar astrovírus) virális metagenomikai (Delwart, 2007; Djikeng et al., 2008; Kapoor et al., 2008; Victoria et al., 2009), pyroszekvenálási és bioinformatikai módszerek alkalmazásával sikerült elızetesen ígéretesnek ítélt mintákból azonosítani. E nagymőszer- és munkaigényes, és jelenleg is költséges, de modern, robosztus szekvencia-független nukleinsav amplifikációs és szekvenáló módszerek azt teszik lehetıvé, hogy környezeti, illetve elızetesen nem manipulált biológiai mintákból a kapsziddal védett virális nukleinsavak (RNS és/vagy DNS) relatív arányának növelésével - a gazda genom arányához képest – bepillantást nyerjünk az adott minta potenciális vírusösszetételébe. Ez azt jelenti, hogy egy mintából – kellı víruskoncentráció esetén - akár több (sok), különbözı víruscsaládba tartozó vírus is egyidejőleg kimutatásra kerülhet. Ez történt példaként a vaddisznó bélsár mintákból, ahol 4 különbözı vírust (porcine kobuvírus, porcine teschovírus, porcine astrovírus és porcine enterovírus) mutattunk ki párhuzamosan ugyanazokból a mintákból. (De hasonlóan több – eddig a legtöbb 7 - új vírus egyidejő jelenléte igazolható szalakóta (Coracias garrulus), pulyka és hal akár egyetlen bélsár mintájában is. Ezek meghatározása folyamatban van.) A virális szekvencia felismerésének alapja, a GenBank adatbázisában mindenkor elérhetı virális nukleotid és aminosav szekvenciákhoz (és elsısorban a konzervatív motívumokhoz) való hasonlóság mértéke. Ezért egy már ismert vírus akár több ezer darabból álló (csaknem teljes) genomszekvencia leolvasása is
megtörténhet a kiindulási mintából, viszont egy új, még ismeretlen szekvenciájú vírus felismerése, amikor maximum 1-4 db 100-200 nukleotid hosszú szekvencia áll csak a GenBank összehasonlítást követıen rendelkezésre, nehéz. Ilyenkor, ha a szekvencia jól ismert, esszenciális aminosav motívumot is kódol, akkor bízhatunk abba, hogy az eddigiektıl eltérı, új vírusra találtunk. Ez történt a virális metagenomikai módszerrel azonosított vírusaink esetén is. Azonban akár aspecifikus RT-PCR reakcióval, akár virális metagenomikai módszerekkel sikerült is az új virális szekvencia darabot beazonosítanunk, mindig az új vírus teljes genetikai állományának (nukleotid sorrendjének) meghatározására törekedtünk. Hisz csak a teljes virális genom meghatározásával tudjuk pontosan összehasonlítani, jellemezni és megfelelıen besorolni a vírusokat, és csak így lehet idıtálló(bb) taxonómiát is kialakítani.
Ellenkezı esetben, attól függıen, hogy milyen régiót vizsgálunk – a korábban írtaknak megfelelıen - fals eredményt („misidentification”), téves osztályozást („misclassification”) és téves következtetést („misinterpretation”) vonhatunk le a vírusunk eredetére, természetére vonatkozóan.
A virális metagenomika eredményei bizonyítják az egyidejő és többszörös virális társfertızések gyakoriságát egy adott (akár tüneteket nem mutató) gazdában. Ennek felismerése fontos következményekkel járhat: bıvíti és finomítja az ismereteinket (különösen a házi haszonállatok esetében). Ez arra utal, hogy csak a pontos genomszintő mikrobiális háttér ismeretében dönthetı el, hogy az adott körülmények között mi tekinthetı kórokozónak (kórokozóknak), opportunistának, a virális flóra alkotójának, vagy ártalmatlan átutazónak az adott szervezetben. E komplex ismeret hatással lehet a kórképek elkülönítésére, pathogenezisükre, a fertızés forrásának felismerésére, a kórokozó átvitelére, valamint a megelızésének kérdéseire is. Másrészrıl az új, burok nélküli, pozitív, egyszálú RNS genomú vírusok kimutatása és meghatározása elvezethet az egyes víruscsaládok tagjainak valódi genetikai sokszínőségének, evolúciójának és egymáshoz való evolúciós rokonságuk
mélységének megértéséhez. Ismereteket szerezhetünk továbbá a fajok közötti határok átlépése és átléphetısége, és a zoonózis/humanózis kérdéseinek pontosabb feltárásához is. A vizsgált víruscsaládok ismert vírusnemzetségeinek (vírus diverzitás) és az ismert gazdafajok (gazdafaj spektrum) jelenleg ismert (állapot: 2012. tavasza) összefüggésének összefoglalására vállalkozik a 15. táblázat, mely jelöli Laboratóriumunk hozzájárulását is az ismeretek bıvüléséhez.
Jelenleg is több új RNS vírusfaj/nemzetség (például picornavírusok, astrovírusok, picobirnavírus, reovírus stb.) meghatározása és közlése van folyamatban Laboratóriumunkból. Ilyen a pulyka (turkey) avisivírus (65. ábra), mely egy új picornavírus nemzetség („Avisivírus” = Avihepatovírus sister-clade vírus) elsı képviselıje a Picornaviridae családban (Boros et al., 2013. nyomtatásban). Vagy a pigeon (galamb) mesivírus („Mesivírus” = Megrivírus sister-clade vírus) (Phan et al., 2013. nyomtatásban) és a szalakótából (Coracias garrulus) kimutatott picornavírus („Kunsagivírus” = Kunság földrajzi névbıl) (Boros et al., 2013. nyomtatásban), melyek ugyancsak egy-egy új picornavírus nemzetség elsı tagjai a Picornaviridae családban (65. ábra). Az elsı kobuvírus kimutatása madárból (szalakóta, Coracias garrulus) is ilyen. Ez utóbbit is az „univerzális” kobuvírus primerrel (UNIV-kobu-R/UNIV-kobu-F) sikerült RT-PCR módszerrel azonosítani, majd összesen három (3/6; 50%) szalakóta egyed fécesz mintájából kimutatni. De sikerült még szalakótákból 3 új astrovírus fajt is azonosítani, és a mosavírust (új picornavírus faj és nemzetség) az Egyesült Államokat követıen (Phan et al., 2011) Európában kimutatni.
Érdekes hozadéka a metagenomikai eredményeknek hazai pontyok bélsár mintájából egy potenciálisan új, – szegmentált RNS genomú - seadornavírus (Reoviridae) faj (Balaton vírus) európai azonosítása és meghatározása (Reuter et al., 2013. nyomtatásban). E vírus BSL-3 besorolású rokonai (pl.: Banna vírus) eddig kizárólag Dél-Kelet Ázsiában voltak ismertek, mint szúnyogok által terjesztett, encephalitist okozó ágensek emberben ...
15. táblázat. Egyes burok nélküli, pozitív, egyszálú RNS genomú vírusok (a táblázat sorai) összefüggése az eddig vizsgált gazdafajokkal (oszlopok).
humán majom sertés szarvasmarha juh ló kecske macska oroszlán kutya vaddisznó ız, szarvas nyúl denevér patkány egér vadászgörény delfin fóka pulyka kacsa csirke fürj galamb szalakóta
Mamastrovírus > 3 5 2 > 1 X
(A táblázat a Caliciviridae és a Hepeviridae család nem minden nemzetségét tartalmazza. Állapot: 2012. tavasza
A vírusfertızések csak egy (minden bizonnyal kis része) jár „szemmel” érzékelhetı klinikai elváltozásokkal, és valószínőleg számtalan, még nem ismert vírus és vírus-variáns jó (akár kölcsönösen elınyös) evolúciós adaptációban „él” a gazdaszervezetével. (Csak összehasonlításként: friss vizsgálatok szerint az emberi szervezet a ~22.000 saját fehérje kódoló génje mellett egyedenként további ~8 millió – a gazdaszervezetet minden pillanatban befolyásoló - bakteriális gént is hordoz magán, mely minimum 10.000 különbözı mikrobafajtól – ez a mikrobiom – származik.) (http://www.nih.gov/news/health/jun2012/
nhgri-13.htm). Konzervatív becslések szerint körülbelül 100 millió vírusfaj (ezen belül 1 millió gerinces vírusfaj) létezhet a földi bioszférában (Witzany, 2012). Az ICTV 2013.
februári, legújabb kiadványa azonban összesen csak 2480 elfogadott vírusfajt tart nyilván (http://talk.ictvonline.org/files/ictv_documents/m/msl/4440.aspx). Jelen ismereteink nagysága (azaz inkább kicsisége) és mélysége (azaz inkább felületessége) a vírusokkal kapcsolatban alázatra int. Nem kérdés, hogy csak most kezdjük megsejteni a vírusok valódi jelentıségét, sokszínőségét („virosphera”) a különbözı gazdasejtekben, gazdaszervezetekben és a bioszférában. Hiba, ha a figyelmünk lankad, vagy elterelıdik a fertızı betegségekrıl és a mikrobákról…
A természet értı leírása vezet a természet megismeréséhez. Bıven van még mit felfedeznie a jelen és leendı virológus nemzedékeinek …