Reverz-transzkripciós polimeráz láncreakció

A direkt víruskimutatási módszerek közül leggyakrabban a reverz-transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR) segítségével vizsgáltuk a mintákban flavivírusok (WNV és USUV) jelenlétét.

A konvencionális (endpoint) RT-PCR vizsgálatokhoz főként a QIAGEN OneStep RT-PCR Kit-et használtuk, a gyártó utasításai szerint. A reakcióelegyek a flavivírus-specifikus, oligonukleotid primereket 0,8 µM koncentrációban tartalmazták. A gerinces gazdákból származó mintákat (döntően szöveti homogenizátumokat vagy fehérvérsejteket) elsősorban a WNV, JEV és MVEV genomszekvenciáinak illesztése segítségével azonosított, az NS5 gén és a 3’UTR régió területén található, erősen konzervált genomszakaszok szekvenciái alapján tervezett, degenerált primerpár

(WNV3f: 5’- GARTGGATGACVACRGAAGACATGCT-3’; és WNV2r: 5’- GGGGTCTCCTCTAACCTCTAGTCCTT-3’; Weissenböck és mtsai., 2002) segítségével vizsgáltuk.

Egyes esetekben a vírusok teljes genomszekvenciáinak meghatározását végeztük el. Ehhez a genom átfedő szakaszait vírus-specifikus oligonukleotid primerekkel felerősítettük, majd az amplifikációs termékek szekvenciáit meghatároztuk és azokat az átfedő területek segítségével összefüggő szekvenciává alakítottuk. Az USUV és a WNV egyes törzseinek teljes genomszekvencia meghatározásához használt primerek szekvenciáit a 2.–5. táblázatok tartalmazzák.

2. táblázat: Az Usutu vírus teljes genomszekvenciáinak felerősítésére és szekvenálására használt oligonukleotid primerek.

Usu5569f CCAATGCACCAGTTACAGAC

a dőlt betűvel szedett: degenerált, JEV-szerokomplex-specifikus primerek

SAAR: primerek az SA Ar-1776 törzs egyes genomterületeinek felerősítésére használt primerek WNV: WNV-specifikus primerek (Weissenböck és mtsai., 2002)

A számok a primer szekvenciák hozzávetőleges helyét mutatják a MVV, JEV és WNV szekvenciák illesztésével készített, konszenzus szekvenciában

f: genomikus (forward) primer; r: komplementer (reverse) primer

b Az Usu731r primerrel alkalmazott primer

c Szekvenáló primer az Usu1f-Usu731r amplikonon

d Az Usu1f primerrel alkalmazott primer

e Szekvenáló primer az Usu7757f-Usu8599r amplikonon

f Szekvenáló primer az Usu10596f-Usu11014r amplikonon

g Szekvenáló primer az Usu488f-Usu1401r amplikonon

h Szekvenáló primer az Usu5709f-Usu7303r amplikonon

i A diagnosztikában WNV3f és WNV2r néven használt primerpár

3. táblázat: Az egyes genetikai vonalhoz tartozó nyugat-nílusi vírustörzsek teljes

a dőlt betűvel szedett: degenerált, JEV-szerokomplex-specifikus primerek (ld. 2. táblázat)

WNV: WNV-specifikus primerek. A számok a primerek 5’végi nukleotidjának pozíciójára utalnak a WNV NY 2000-crow3356 vírustörzs (GenBank azonosító: AF404756) alapján.

f: genomikus (forward) primer; r: komplementer (reverse) primer

4. táblázat: A kettes genetikai vonalhoz tartozó nyugat-nílusi vírustörzsek teljes genomszekvenciáinak

a dőlt betűvel szedett: degenerált, JEV-szerokomplex-specifikus primerek (ld. 2. táblázat)

WNV: WNV-specifikus primerek. A számok a primerek 5’végi nukleotidjának pozíciójára utalnak a WNV B956 vírustörzs (GenBank azonosító: NC_001563) alapján.

f: genomikus (forward) primer; r: komplementer (reverse) primer

5. táblázat: A hármas genetikai vonalhoz tartozó nyugat-nílusi vírustörzsek teljes

a dőlt betűvel szedett: degenerált, JEV-szerokomplex-specifikus primerek (ld. 2. táblázat) WNV: WNV lineage 1 és lineage 2 -specifikus primerek (ld. 3. és 4. táblázat).

f: genomikus (forward) primer; r: komplementer (reverse) primer

A primereket a Primer Designer 4.0 (Scientific and Educational Central) program segítségével terveztük és különböző szolgáltatóktól (Sigma-Aldrich, St. Louis, Egyesült Államok; Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium, Microsynth AG, Balgach, Svájc, stb.) szereztük be. Az RT-PCR reverz transzkripciós lépését (50°C, 30 perc) 94°C-on 15 perc inkubáció követte a reverz transzkriptáz enzim inaktiválása és a HotStarTaq DNS polimeráz aktiválása céljából. A cDNS amplifikációja 94°C, 40 másodperc denaturáció, 57°C, 50 másodperc primertapadás és 72°C, 1 perc láncszintézis lépésekkel, 40 ismétléssel történt. A reakciókat 72°C, 7 perc végső szálszintézis lépés zárta le, amelyet követően az elegyeket a készülék leállításig 4°C-on tárolta. A reakciókban pozitív kontrollként szövettenyészeten elszaporított vírustörzsekből kivont RNS-t, negatív kontrollként vizet használtunk.

Az amplifikációs termékek kimutatására 5 µl terméket 1µl 6× töménységű felvivőpufferrel (Promega) összekeverve, 1,4%-os agaróz-gélben elektroforetizáltuk, 8 V/gélcm feszültség mellett, 70 percig. A termékek hozzávetőleges méretét molekulatömeg marker (100 bp Ladder, Promega) segítségével határoztuk meg. A nukleinsavat etídium bromid vagy azzal ekvivalens DNS festék (Greensafe, NZYTech, Liszabon, Portugália) segítségével festettük meg és UV fényben, 312 nm hullámhosszon vizsgáltuk. Az eredményeket elektronikusan dokumentáltuk és tároltuk (Kodak DS Electrophoresis Documentation and Analysis System, Kodak, Rochester, USA).

Nagyszámú minta vizsgálata, illetve a mintákban jelen levő WNV vagy USUV nukleinsav mennyiségi meghatározása céljából TaqMan módszerre alapuló valós idejű (real-time) RT-PCR rendszereket dolgozunk ki. A 2004-ben Magyarországon felbukkant, kettes genetikai vonalú WNV törzs teljes genomszekvenciája (GenBank azonosító: DQ116961) alapján tervezett primerek (WNV 5009f, GAACGTCAGGTTCCCCCATT) és (WNV 5103r, GGCGCTTATGTATGAACCATTAGG) 95 nukleotid hosszúságú genomszakaszt erősítenek fel a NS3 fehérje gén területén. A TaqMan probe (WNV 5050p, FAM-ATTGGATTGTATGGGAACGGCGTCATC-TAMRA) a termékre tapad és a reakció során hidrolizálódik. A rendszert a későbbiekben annyival módosítottuk, hogy TAMRA helyett Black Hole Quencher molekulát használtunk. A primereket és a probe-ot az AbiPrism Primer Express 2.0.0 software (Applied Biosystems, USA) segítségével terveztük. SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System kitet (Invitrogen, USA) használtunk a reakciók során, a gyártó utasításai szerint. A reakcióelegyek 5 pmol genomikus és reverz primert, valamint TaqMan probe-ot tartalmaztak. Az amplifikációt Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System készülékben végeztük. Minden mintát kétszer mértünk fel a lemezre. A reakció hőprogramja: reverz transzkripció:

48°C, 15 perc, reverz transzkriptáz denaturáció és Taq polimeráz aktiváció: 95°C, 2 perc, [denaturáció: 95°C, 15 másodperc és primertapadás+láncszintézis: 60°C, 30 másodperc] 45 ismétléssel. A fluoreszcenciát az elongációs lépés alatt mértük. A nukleinsav mennyiségét abszolút kvantifikációs módban határoztuk meg, az 578/10 WNV törzsből tisztított RNS 1:10 arányú hígítási sorához viszonyítva. Az USUV nukleinsavának kimutatására kifejlesztett TaqMan real-time RT-PCR próbában a genomikus (5’- GCCAATGCCCTGCACTTT -3’) és komplementer (5’-

TCCCGAGGAGGGTTTCCA -3’) primerek az NS5 fehérje gén területén erősítik fel a 9721 és 9795 nukleotid pozíció közötti területet (GenBank azonosító NC_006551). A TaqMan probe (FAM- 5’-CGATGTCCAAGGTCAGAAAAGACGTGC-3’-TAMRA) a 9746 és 9773 közötti nukleinsav szekvencával hibridizál. A reakciókat ebben az esetben is SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR System kittel végeztük; a reakcióelegy 0,2 µM koncentrációban tartalmazta a primereket és a probe-ot. Az alkalmazott hőprogram: 48°C, 15 perc; 95°C, 2 perc; 45× [95°C, 15 másodperc; 60°C, 30 másodperc]. Ezt a módszert használtuk szúnyogminták vizsgálatára is, mivel a fent leírt, konvencionális RT-PCR módszerrel aspecifikus termékek képződését tapasztaltuk; valamint kórszövettani mintákból a vírusRNS kimutatására, mivel azokban a formalinos fixálás hatására a nukleinsav töredezhetett, így a nagyobb méretű termékeket amplifikáló diagnosztikai PCR rendszerek nem mindig voltak megbízhatóan használhatók.