5. Eredmények
5.5. Porfirin-peptid konjugátumok kötődése természetes polinukleotidhoz és
Az irodalomban számos példát látunk porfirinek és porfirin származékok természetes illetve szintetikus szerves vegyületek (pl. oligonukleotid, oligopeptid, monoszacharid, oligoszacharid) konjugátumainak előállítására [65,73,84,85,275]. A konjugátumok előállításának motivációja lehet a porfirin célzott sejtbejuttatásának elősegítése vagy sejten belüli lokalizációjának megváltoztatása. A kationos porfirin származékok és a nukleinsavak ismert kölcsönhatásának alapján ebben az esetben a konjugáció egy másik aspektusa is felmerül, nevezetesen a kationos porfirinekhez kapcsolt ligandumok eljuttatása a sejten belüli nukleinsav – például sejtmag DNS, mitokondriális DNS – környezetébe.
Munkánk során a kationos porfirinekhez kapcsolt peptid ligandumok célbajuttatásának lehetőségeit, feltételeit kívántuk vizsgálni. Ennek érdekében kationos porfirinek oligopeptid és polipeptid konjugátumait állítottuk elő. A konjugáció kémiai feltételei miatt a korábban részletesen tanulmányozott tetrakationos TMPyP közvetlenül nem alkalmas peptidkonjugátumok előállítására. Ezért egy három és egy két pozitív töltéssel rendelkező származékot, tri(4-N-metilpiridil)-mono-(4-carboxifenil)porfirin-t (TMPCP) és mezo-5,10-bis(4-N-metilpiridil)-15,20-di-(4-karboxifenil)porfirin-t (BMPCP) választottunk. E vegyületek egy illetve két, konjugálásra alkalmas karboxilcsoportot hordoznak. Ennek megfelelően a TMPCP-re egy, a BMPCP-re két peptid lánc kapcsolható. A TMPCP és BMPCP kötődését DNS-hez és nukleoprotein komplexhez a korábbi fejezetekben (lásd 5.2.1.3 és 5.2.2 fejezet) elemeztük.
Oligopeptidként egy tetrapeptidet választottunk (lásd anyag és módszer fejezet). A TMPCP-4P és BMPCP-TMPCP-4P2 (lásd anyag és módszer fejezet) alkalmas modelljei lehetnek porfirin-oligopeptid konjugátumoknak. Ezen túlmenően az itt használt tetrapeptid a 12. ábra szerinti alkotó egysége a széles körben használt polilizin gerincű elágazó láncú polipeptideknek (12.
ábra). Az oligopeptidek mellett előállítottuk a TMPCP polipeptiddel képzett konjugátumát (TMPCP-AK, lásd 4.2. fejezet).
Vizsgáltuk az oligpeptid és polipeptid konjugátumok kötődési tulajdonságait izolált DNS-hez, nukleoprotein komplexDNS-hez, jellemeztük sejtbe jutásukat és követtük sejten belüli lokalizációjukat.
Szemléltetésül a három konjugátum izolált DNS-sel való titrálásakor regisztrált abszorpciós spektrumsorozatát mutatom az 53. ábrán. Mindhárom konjugátom elnyelési spektruma megváltozik a polinukleotid jelenlétében. A tetrapeptid konjugátumok (TMPCP-4P és BMPCP-4P2) spektrumsorozatában mind a hipokrómiát, mind a vörös eltolódást felfedezhetjük. A polipeptid konjugátum (TMPCP-AK) spektrumsorozatában az utóbbi nem kifejezett.
Ugyanakkor kötődéskor a spektrumokban a komponens sávok között a =435 nm-es maximummal rendelkező komponens is megjelenik, sőt ez az egyetlen sáv, amelynek területe nő a bázispár koncentráció növekedésekor. A spektrumsorozatok felbontásakor kapott komponensek maximum helyeit (i nm) és sávszélességét a 20. táblázatban foglalom össze.
53. ábra TMPCP-4P (A), BMPCP-4P2 (B) és TMPCP-AK (C) abszorpciós spektrumának változása izolált T7 DNS-hez való kötődés során (Tris-HCl, pH 7,4). Az első és utolsó spektrumhoz tartozó bázispár/porfirin arányokat az ábrákban látható r értékek, a spektrum
változásának irányát a nyilak jelzik.
20. táblázat A porfirin-konjugátumok szabad és kötött állapotainak abszorpciós spektroszkópiai jellemzői =370-490 nm tartományban (Tris-HCl puffer, pH 7,4): az
abszorpciós sávok maximumhelyei i (nm) és a sávok szélessége wi, (nm). i hibája ˂1 nm, wi
hibája ˂ 0,5 nm.
Vegyület Partner 1 (nm) w1 (nm) 2 (nm) w2 (nm) 3 (nm) w3 (nm) 4 (nm) w4 (nm) közös váll csúcs (szabad) csúcs (kötött)
BMPCP-4P2 DNS 407 17 418.5 11 429 11 435 16
NP 410 23 418 9 422 14 426 23
NP(65) 410 21 418 8 421 15 427 20
TMPCP-4P DNS 402 15 422 17.5 429 25 446 25
NP 403 15 422 16 427 25 435 27
NP(65) 403 16 422 16 427 27 435 29
TMPCP-AK DNS 407 418 421 435
54. ábra A TMPCP-4P (A) és BMPCP-4P2 (B) abszorpciós sávjainak relatív területe izolált DNS jelenlétében a bázispár/porfirin mólarány (r) függvényében a sávok maximumhelyeinek
pozíciója szerint. TMPCP-4P: 402 nm (X), 422 nm (□), 429 nm (○), 446 nm (▲); BMPCP-4P2: 407 nm (x), 418 nm (□), 429 nm (○), 435 nm (▲). (Tris-HCl puffer, pH 7,4) Látható, hogy akárcsak az abszorpciós spektrum komponenseinek száma és maximumhelye, azok bázispár/porfirin mólaránnyal mutatott változása is informatív a kötött formák számára illetve relatív mennyiségére vontkozóan. Ennek alapján a két tetrapeptid konjugátum, a TMPCP-4P (54.A ábra) és a BMPCP-4P2 (54.B ábra) két spektrumkomponense mutat
növekedést az r érték növekedésével, míg a TMPCP-AK konjugátum esetében (55. ábra) csak egy kötődésre utaló komponens jelenik meg. (Megjegyzem, hogy az ábrákon látható görbék csak a jobb követhetőséget szolgálják, illesztési paramétereik nem szolgáltatnak adatot a kötődésre vonatkozóan.)
55. ábra A TMPCP-AK abszorpciós sávjainak relatív területe izolált DNS jelenlétében a bázispár/porfirin mólarány (r) függvényében a sávok maximumhelyeinek pozíciója szerint:
407 nm (x), 418 nm (□), 421 nm, 435 nm (▲)(Tris-HCl puffer, pH 7,4)
Ugyanígy csak egy kötődési módra mutató sáv jelenik meg a tetrapeptid konjugátumok, (TMPCP-4P és BMPCP-4P2) abszorpciós spektrumaiban nukleoprotein komplex jelenlétében (56.A és B ábra). A sáv pozíciója alapján nem dönthető el, hogy ez milyen kötött forma jelenlétére utal. A polipeptid konjugátum (TMPCP-AK) abszorpciós spektrumai nem mutatnak változást hasonló körülmények között (ábra nélküli adat).
56. ábra A TMPCP-4P (A) és BMPCP-4P2 (B) abszorpciós sávjainak relatív területe NP jelenlétében a bázispár/porfirin mólarány (r) függvényében a sávok maximumhelyeinek pozíciója szerint. TMPCP-4P: 403 nm (X), 422 nm (□), 427 nm (○), 435 nm (▲);
BMPCP-4P2: 410 nm (X), 418 nm (□), 422 nm (○), 426 nm (▲). (Tris-HCl puffer, pH 7,4)
A kötődés további bizonyítéka lehet a fluoreszcencia élettartam megváltozása, kötött formákra jellemző lecsengési komponensek megjelenése (21 táblázat).
21. táblázat A BMPCP-4P2 és TMPCP-4P fluoreszcencia élettartamának komponensei Tris-HCl pufferben (pH7,4) szabad állapotban, DNS, NP és NP(65 °C) jelenlétében (r=30).
Vegyület Partner
[ns]
[ns]BMPCP-4P2 - 8,99 ± 0,28 -
DNS 2,36 ± 0,12 9,76 ± 0,12
NP - 9,14 ± 0,24
NP(65) 3,08 ± 0,19 10,25 ± 0,27
TMPCP-4P - 4,9 ± 0,15
DNS 3,46 ± 0.18 9,50 ± 0,23 NP 3,13 ± 0,17 9,87 ± 0,27 NP(65) 3,19 ± 0,25 9,74 ± 0,19
A BMPCP-4P2 NP jelenlétében mono-exponenciális lecsengést mutat. A 21. táblázatban bemutatott többi esetben az élettartam komponensek két kötött forma meglétét támasztják alá.
A kötődés formáinak azonosítására a fluoreszcencia energia transzfer és a CD spektrumok vizsgálatát alkalmaztuk. A TMPCP-4P, mind DNS (57. ábra) mind NP (58. ábra) jelenlétében kifejezett fluoreszcencia intenzitás növekedést mutat a DNS elnyelési maximumán, =260 nm-en történő gerjesztéskor. NP esetébnm-en ez a növekedés kisebb, mint DNS jelnm-enlétébnm-en, és még a NP 65 °C-előkezelése után sem éri el az izolált DNS jelenlétében látott értékeket. A BMPCP-4P2 is akceptorként viselkedik izolált DNS és hőkezelt NP mellett, az intakt NP jelenlétében megjelenő fluoreszcencia intenzitás viszont nem bizonyító erejű az interkalációra nézve.
57. ábra (A) A TMPCP-4P (■) és BMPCP-4P2 (□) integrált fluoreszcencia intenzitása (em=600-770 nm; g=260 nm) izolált T7 DNS bázispár/porfirin mólarány (r)
függvényében. (Tris-HCl puffer, pH 7,4)
58. ábra (A) A TMPCP-4P (○) és BMPCP-4P2 (△) integrált fluoreszcencia intenzitása (em=600-770 nm; g=260 nm) T7 NP-hez (fekete) és 65 °C-ra felmelegített T7 NP-hez (piros) történő kötődéskor bázispár/porfirin mólarány (r) függvényében. (Tris-HCl puffer,
pH 7,4)
A fluoreszcencia élettartam és energiatranszfer adatokkal összhangban vannak a DNS illetve NP tartalmú oldatokban regisztrált porfirin származékok CD spektrumai (59. ábra). A TMPCP-4P CD spektrumai minden bemutatott körülmény mellett tartalmazzák a pozitív, és az interkalációra mutató negatív sávokat. A BMPCP-4P2 spektrumában T7 NP jelenlétében nem jelenik meg a negatív sáv, de határozott a pozitív sáv a spektrumban.
A TMPCP-AK polipeptid konjugátum esetében egyik módszerrel sem volt kimutatható az interkalált forma kialakulása.
59. ábra TMPCP-4P(folytonos vonal) és BMPCP-4P2 (szaggatott vonal) CD spektrumai izolált DNS-hez (A) T7 NP-hez (B) és 65 °C-ra felmelegített T7 NP-hez (C) történő kötődéskor
(Tris-HCl puffer, pH 7,4). A porfirin koncentráció 1M, r=30.
A DNS-en és a NP-en belüli ligandum-makromolekula kapcsolatokról adhatnak felvilágosítást az abszorpciós olvadási görbék (60. ábra).
Mindhárom peptid-konjugátum kötődése az izolált, B-konformációjú DNS-hez (Tris-HCl puffer, pH 7,4) növeli a láncszétváláshoz tartozó hőmérsékletet, azaz a konjugátumok stabilizálják a DNS szerkezetét (60.A és B ábra). Ha a fázisátalakulási hőmérsékleteket tekintjük a porfirin/bázispár (1/r) függvényében [276], a mérési pontokra illesztett lineáris függvény meredeksége jellemezheti a stabilizáló hatás mértékét. Az egyes kölcsönhatásokat jellemző egyenesek meredekségét a 22. táblázat mutatja.
60. ábra T7 fágból izolált DNS (A,B) és T7 fág (C,D) TMPCP-4P-t (A,C) és BMPCP-4P2-őt (B,D) tartalmazó oldatainak abszorpciós olvadási görbéi. A minták bázispár koncentrációja 15±2 M. A porfirin/bázispár mólarány 0-0,046 (A), 0-0,1 (B), 0-0,12 (C), 0-0,23 (D) között változott. A görbék eltolódási irányát a növekvő porfirin koncentrációnak megfelelően az
ábrán nyilak jelzik. (Tris-HCl puffer, pH 7,4) 22. táblázat DNS láncszétválási hőmérséklet -
porfirin/bázispár (1/r) mólarány függvény meredeksége Vegyület Partner Meredekség [°C*r]
BMPCP-4P2 DNS 22,72
NP 3,3
NP(65) 8,48
TMPCP-4P DNS 80.58
NP 30,4
NP(65) 27,9
TMPCP-AK DNS 9,23
A NP első, a kapszid fellazulásához köthető fázisátalakulási hőmérsékletet a TMPCP-4P és a TMPCP-AK konjugátum nem befolyásolja, sem az átalakulás hőmérsékletét, sem annak kooperativitását. A BMPCP-4P2 tetrapeptid-konjugátum kismértékben megnöveli az átmenethez tartozó hőmérsékletet, stabilizálja a kapszid szerkezetét illetve a fehérje-DNS kapcsolatot. A kapszidba zárt DNS fázisátalakulási hőmérsékletét a két tetrapeptid konjugátum növeli, míg a TMPCP-AK nem befolyásolja. A hatékonyságra jellemző meredekségeket szintén a 22. táblázat tartalmazza.
A tetrapeptid-konjugátumok stabilizáló hatása kifejezetteb az izolált DNS, mint a kapszidban elhelyezkedő DNS esetén. Ugyanakkor az is világos, hogy a fehérje kapszid csökkenti, de nem zárja ki a porfirin származék tartalmú konjugátum-DNS kölcsönhatás lehetőségét.