5. Eredmények
5.7 Porfirin származékok fototoxicitása
5.7.1. A fotodinamikus reakció hatékonysága és mechanizmusa
A porfirin származékok orvosi/biológiai alkalmazási lehetőségeinek alapja a fotodinamikus reakció. A keletkező reaktív termékek, szabadgyökök illetve szingulett oxigén a sejtekben destrukciós folyamatokat indítanak el, amik aztán a sejtek illetve vírusok pusztulásához vezethetnek. A dolgozatban vizsgált valamennyi származék feltételezéseink szerint alkalmas lehet ilyen fotodinamikus reakciókban való alkalmazásra. Ennek lehetőségét, a reakciók mechanizmusát vizsgáltuk és összehasonlítottuk az egyes vegyületek várható hatékonyságát.
A porfirin származékok fototoxicitásának mértékét meghatározó paraméterek közül egyik legfontosabb szingulett oxigén termelési hatásfokuk.
Munkánk során jodometriás titrálással vizsgáltuk a porfirin származékok relatív szingulett oxigén termelési hatásfokát (65. ábra). A keletkező szingulett oxigén mennyiségére a keletkező ionok I3abszorbanciájából származó, =355 nm-en mért abszorbancia növekedésből következtethetünk. Az egyes származékok hatékonyságának összehasonlítását a 65. ábrán mutatom be.
Az abszorbancia növekedése a kezdeti lineáris változás után minden esetben telítés felé hajlik. Ennek egyik oka lehet a porfirin származék fotokémiai bomlása/átalakulása. Mint ismeretes a porfirinek – molekulaszerkezetüktől függően különböző mértékben – fény hatására bomlanak, illetve átalakulnak [278].
65. ábra A jodometriás reagenst és porfirin származékot tartalmazó oldatok abszorbanciájának változása =355 nm-en a beeső dózis függvényében. (A): 0,5 M TP(4-OgluOH)4P (△), TP(4-OgluOH)3P (▽), TPF5(4-OGalOH)3P (o); (B): 0,5 M TMPyP (▽), TMPCP(△), BMPCP (o), TMPCP-4P ((□), BMPCP-4P2 (x); C: 0,5 M (△), 1 M (x) , 1,5
M (+) , 2 M (*) TMPCP
Tapasztalataink szerint a kationos porfirin származékok fotokémiai átalakulása a használt dózis tartományban elhanyagolható (nem szemléltetett adat), de számottevő lehet a glikozilált porfirinek esetében. Ennek egy példáját mutatom be a 66. ábrán a TPF5(4-OGalOH)3P vonatkozásában.
A továbbiakban teszteltük és összehasonlítottuk az egyes származékok fototoxicitását T7 bakteriofág rendszeren. Választásunkat az indokolta, hogy a kérdéses porfirin származékok egyik fontos felhasználási területe lehet a patogén vírusok inaktiválása. Ebből a szempontból tekintve a T7 bakteriofág választásának több előnye is mutatkozik. Egyrészt a T7 modellje lehet a peplonnal nem rendelkező, akár DNS, akár RNS vírusoknak. További előny, hogy a nagy optikai tisztaságú T7 preparátumokon közvetlenül is vizsgálható a vírusinaktiváció szerkezeti háttere is.
66. ábra A TPF5(4-OGalOH)3P fotodegradációja: a porfirin Soret-sávjának maximumán mért relatív abszorbancia 0,7 (△ ), 1,4(□) és 2,8 (o) M koncentrációjú oldatokban .
(Tris-HCl, pH7,4)
Tisztában kell lennünk ugyanakkor azzal, hogy a vírusinaktivációban észlelt hatékonyság, különösen az apoláros, membrán struktúrákban lokalizálódó porfirinekre nézve nem ad támpontot a sejtekben várható hatékonyságra nézve.
67. ábra TP(4-OgluOH)4P-nal (A) és TP(4-OgluOH)3P-nal (B) szenzibilizált T7 fág fotoinaktivációja scavenger nélkül (▽), illetve DPBF (x) (0,1 mM) vagy DMTU (□) (5mM) jelenlétében. A fágpartikulumok koncentrációja 0.3 nM, a porfirinkoncentráció 2 M volt.
(Tris-HCl, pH7,4)
T7 fág szuszpenziót porfirinek jelenlétében látható fénnyel besugároztunk és lemezöntéssel meghatároztuk a fertőzőképes fágok számát a beeső dózis függvényében. Példaként a 67. ábrán
a TP(4-OgluOH)4P-nal (67.A ábra) és TP(4-OgluOH)3P-nal (67.B ábra) szenzibilizált fágok inaktivációs kinetikáját mutatom be.
Az inaktivációs kinetikából meghatározható az inaktivációs keresztmetszet (), vagyis annak a dózisnak a reciproka, ami az aktív fágok számát e-ed részére csökkenti (ln(N/N0)=1).
Az egyes vegyületekkel szemben mutatott inaktivációs keresztmetszetre vonatkozó adatokat a 23. táblázatban foglalom össze. Mivel fotoszenzibilizáló vegyület alkalmazása mellet függ az alkalmazott koncentrációtól, az összehasonlíthatóság érdekében a táblázatban feltüntetett adatok egységesen 2 M porfirin koncentrációjú oldatokra vonatkoznak.
23 táblázat A különböző porfirin származékokkal érzékenyített T7 fág inaktivációs hatáskeresztmetszete (
[cm2/kJ]) scavenger (NaN3, illetve DMTU) jelenlétében és jelenléte nélkül. A scavenger koncentrációja 1 mM, a porfirin koncentrációja 2 M.(Tris-HCl,, pH7,4) (sx 5%)
Vegyület
[cm2/kJ]
-
NaN
3DMTU
TP(4-OgluOH)4P 8,84 5,11 1,89
TP(4-OgluOH)3P 3,30 0,86 1,84
TPF5(4-OGalOH)3P 38,46 30,30 7,14
TMPyP 62,51 16,00 39,07
TMPCP 50,4 15,7 30,8
BMPCP 43,5 20,28 10,45
TMPCP-4P 15 5,66 6,25
BMPCP-4P2 18 7,93 8,42
A fotoinaktiváció mechanizmusának vizsgálatára a fáginaktivációs méréseket elvégeztük olyan scavengerek jelenlétével a reakcióelegyben, amelyek a szingulett oxigén (DPBF illetve NaN3) vagy a szabadgyökök (DMTU) közömbösítésére képesek. Ezek hatását szemléltetem a 67. ábrán. Az így kapott inaktivációs hatáskeresztmetszeteket pedig a 23. táblázat tartalmazza.
A táblázatban feltüntetett adatok 1 mM scavenger koncentrációkra vonatkoznak. A scavengerek hatékonysága, s ezzel a bakteriofág inaktivációs hatáskeresztmetszete függ a
scavenger koncentrációjától, de tapasztalataink szerint 1 mM felett már nem változik szignifikánsan (nem szemléltetett adat).
A kationos porfirinek – különösen TMPyP – kiemelkedő vírusinaktiváló hatékonyságával kapcsolatban joggal merül fel a kérdés, hogy ez vajon a DNS-hez való kötődésüknek köszönhető-e, vagyis annak, hogy a DNS közvetlen közelében elhelyezkedve vesznek részt reaktív ágensek létrehozásában. Ezért megvizsgáltuk a T7 fág kationos porfirinekkel szembeni inaktivációs hatáskeresztmetszetét nemcsak különböző porfirin származék koncentráció, hanem különböző bázispár/porfirin arányok mellett is [238]. A bázispár/porfirin arányokat úgy választottuk meg, hogy azok egy tartományában csak kötött, más tartományában pedig kötött és szabad porfirin is legyen a rendszerben.
68. ábra (A) A TMPyP-vel szenzibilizált T7 bakteriofág inaktivációs hatáskeresztmetszete () a bázispár/porfirin mólarány függvényében 4 M (o), 2,5 M (󠄉), 1 M (△) és 0,6 M (◊)
porfirin koncentrációjú oldatokban. A mérési sorozatok pontjaira két szakaszban (r >9 és r
˂9) illesztettünk regressziós egyenest. (B) A TMPyP-vel szenzibilizált T7 bakteriofág inaktivációs keresztmetszete () a porfirin koncentráció függvényében r=9 (+) és r=4 (x)
bázispár/mólarányú oldatok sorozatában. (Tris-HCl puffer, pH7)
A 68.A ábra mutatja az inaktivációs hatáskeresztmetszet () változását a bázispár/porfirin arány (r) függvényében különböző porfirin koncentrációk mellett. Minden koncentrációra nézve világosan látszik, hogy az r>9 és r˂9 tartományokban a görbék meredeksége markánsan eltér egymástól. (Emlékeztetek, hogy a 5.2.2.1. fejezetben bemutatott eredmények alapján ez az érték jó egyezést mutat a telítéshez vezető bázispár/porfirin aránnyal.) Mindkét szakasz pontjaira külön-külön megfelelő korrelációval illeszthető egyenes, de az egyes szakaszokra illesztett egyenesek meredeksége szignifikánsan eltér egymástól. Két kiválasztott bázispár/porfirin aránynál (r=4 és r=9) megmutatom változását a koncentráció függvényében.
(68.B ábra). Az r=9 esetben jó közelítéssel csak kötött porfirin van a rendszerben, míg r=4-nél
a koncentráció növelésével nő a nem kötött porfirin mennyisége is. Ez utóbbi esetben az inaktivációs hatáskeresztmetszet koncentrációval való növekedésének meredeksége egy nagyságrenddel nagyobb.