A plazmamembránhoz kötődő fehérjék sejten belüli mozgásának követésére

Kísérleteink során számos plazmamembránhoz (PM) irányított Venus fehérjét készítettünk perifériás PM fehérjék irányító-szekvenciájának felhasználásával (169). A konstrukciók létrehozásakor maximálisan figyelembe vettük az irányítószakaszoknak az eredeti fehérjékben elfoglalt helyzetét, tehát azokat a Venus fehérje megfelelő oldalaihoz kapcsoltuk (7. A ábra).

7. ábra – A kísérleteinkben használt konstrukciók felépítése és PM-kötésének mechanizmusa (A) Az általunk használt konstrukciók felépítésének sematikus ábrázolása. A Venus fehérje módosításához a jelölt perifériás PM fehérjék N- és C-terminálisan elhelyezkedő irányító-szekvenciáit használtuk fel. (B) Az alkalmazott irányító-szekvenciák részletes aminosavsorrendjének és a szakaszokon belül létrejövő poszttranszlációs lipidmódosítások bemutatása. A színek a módosítás helyéül szolgáló aminosavakat jelölik: kék – palmitoiláció, zöld – mirisztoiláció, barna – preniláció, piros – polibázikus aminosavak a szekvencián belül. A táblázat lipidmódosítást jelző oszlopában *-ok a módosítás*-ok számát jelöli.

A fúziós fehérjék tervezésekor olyan perifériás PM fehérjéket választottunk, melyek irányító-szekvenciái más típusú PM kötődést tesznek lehetővéaz eltérő poszttranszlációs módosításoknak megfelelően. A Lyn fehérje N-terminálisának első 14 aminosava (Lyn 1-14-Venus) egyszeresen mirisztoilálódik és egyszeresen palmitoilálódik, az Lck kináz N-terminálisának első 10 aminosava (Lck1-10-Venus) egyszeresen mirisztoilálódik és kétszeresen palmitoilálódik, a c-Src N-terminális első 15 aminosava (c-Src1-15-Venus) csak egy szimpla mirisztoiláción esik át. A K- és H-Ras fehérjék esetében a fehérjék PM-hoz való irányításában a fehérjék C-terminális szakasza játszik szerepet. Ennek megfelelően a Venus fehérje C-terminális oldalához kapcsoltuk a két izoforma utolsó 22 aminosavából álló szakaszt (Venus-Ras-CAAX és Venus-H-Ras-CAAX), amely a

K-csoportot is kap a poszttranszlációs módosítások során (7. B ábra). Fontos megjegyezni azonban, hogy a c-Src és a K-Ras fehérjék irányító-szekvenciáiban számos pozitív töltésű aminosavat is találhatunk, melyek fontos szerepet töltenek be a fehérjék megfelelő PM lokalizációjának létrehozásában a PM negatív töltésű foszfolipidjei és az említett szakaszok között kialakuló elektrosztatikus interakció által.

Az irányító-szekvenciákat tartalmazó fúziós fehérjék létrehozása után arra voltunk kíváncsiak, hogy a vártaknak, illetve az irodalmi adatoknak megfelelően (162,163,170) a PM-on helyezkednek-e el. Ehhez a konstrukciókat HEK 293T sejtekben fejeztük ki, és megvizsgáltuk azok sejten belüli elhelyezkedését konfokális mikroszkóp segítségével. A 8. ábrán is szépen látható, hogy a fehérjék szépen kirajzolták a sejtek plazmamembránját, azonban a legtöbb esetben intracellulárisan is láthatunk fluoreszcens jelet, melynek mennyisége azonban elmaradt a PM intenzitásához képest.

8. ábra – A PM-hoz irányított Venus konstrukciók sejten belüli elhelyezkedésének vizsgálata Az irányító-szekvenciákkal módosított Venus fehérjék intracelluláris lokalizációja, a fehérjéket tranziensen kifejező HEK 293T sejtekben, konfokális mikroszkóppal készült reprezentatív képeken. Lépték: 20 μm.

Munkacsoportunk korábban kifejlesztett egy olyan biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer (BRET) alapú módszert, mellyel sikeresen követhető volt egy luciferáz enzimmel jelölt receptor sorsa és útvonala az ingerlése és az azt követő internalizálódása után a Venus fluoreszcens fehérjével jelölt endomembrán-rendszereken keresztül (75,171). Munkám során a korábban kidolgozott rendszerhez képest a legfontosabb módosítás az volt, hogy az endomembrán rendszereket jelöltem luciferáz enzimmel, míg a PM-hoz irányított fehérjéket, melyek mozgását vizsgálni akartam, Venus fluoreszcens fehérjéhez kapcsoltam (9. ábra). Erre azért volt szükség, mert az előzetes kísérletek szerint az endomembrán rendszerekhez irányított fehérjéink sejten belüli elhelyezkedése specifikusabb volt, mint a PM-hoz irányított konstrukcióké. Ez azért fontos, mert a BRET mérések során a jel nagyságát az interakcióban szereplő donormolekulák száma szabja meg, így a mérések során nagyobb jel-zaj aránnyal számolhattunk.

9. ábra – A hoz irányított Venus konstrukciók követésükre kidolgozott módszer vázlatos bemutatása A PM-t elhagyó fehérjék mozgásának nyomon kövePM-tésére kidolgozoPM-tPM-t BRET-módszer működésének elve. A kísérletek során az interakció változását a sejt endomembrán rendszereit jelölő luciferáz enzim, és a PM fehérjék irányító-szekvenciáival módosított Venus között mértük. (mito: mitokondrium, ER: endoplazmás retikulum, EE: early endosome – korai endoszóma, Luc: luciferáz)

Munkacsoportunk korábbi munkáihoz képest további változás volt, hogy a luciferáz enzim egy újabb, továbbfejlesztett verzióját használtam. Az endomembránokhoz történő irányításhoz, hasonlóan ahhoz, ahogy a PM-hoz történő irányítást végeztem, rezidens

fehérjék irányító-szekvenciáit, illetve teljes hosszúságú fehérjéket használtam fel (10. A ábra).

10. ábra – Az endomembránokhoz irányított luciferáz konstrukciók felépítése és sejteken belüli elhelyezkedése (A) A BRET kísérletekben használt luciferáz konstrukciók vázlatos felépítése, az endomembránokhoz (EM) történő irányításban használt fehérjék, vagy irányító-szekvenciáik jelölésével. (AA: aminosav) (B) Az endomembránokhoz irányított luciferáz konstrukciók intracelluláris lokalizációjának ellenőrzéséhez a luciferáz enzimet Cerulean fluoreszcens fehérjével helyettesítettük, és megvizsgáltuk a sejten belüli elhelyezkedésüket a konstrukciókat tranziensen kifejező HEK 293T sejteken. Lépték: 20 μm. (mito: mitokondrium, ER: endoplazmás retikulum, EE: early endosome – korai endoszóma)

A Golgihoz való irányításban a TGN38 fehérjének a teljes szakaszát, a mitokondriumok esetén a TOM70 fehérje irányító-szekvenciáját (N-terminális első 30 aminosav), az endoplazmás retikulumnál (ER) a Sac1 fehérje C-terminális (527-587 aminosav) darabját, míg akorai endoszómákhoz történő irányításhoz az EEA1 fehérje C-terminális irányító-szekvenciáját (1253-1411 aminosav, ami a FYVE-doménnek felel meg) használtam (10. A ábra). A fehérjék megfelelő lokalizációjának megállapításához elkészítettem a fúziós fehérjék Cerulean fluoreszcens fehérjével jelölt változatait is, és konfokális mikroszkóp segítségével ellenőriztem sejten belüli elhelyezkedésüket (10. B ábra).