A kapacitatív kalcium-beáramlás (SOCE) szerepe és szabályozása emlős

A SOCE során az extracelluláris térből egy csatornán keresztül Ca²⁺-ionok lépnek be a citoplazmába. A Ca²⁺-áramot két fehérje, az ER-ban található STIM (-1 és -2) (139) és a PM-ban található Orai (1, 2 és 3) (140-142) fehérjék kapcsolódása indítja be, melynek kezdeti lépése a sejt kalciumraktárának, az ER-nak a Ca²⁺-depléciója. Az ER típusosan a PLC enzimek aktivációját követően, a citoplazmatikus Ins(1,4,5)P3-koncentráció emelkedésekor tesz szert olyan mértékű permeabilitásra, amely az ionok nagyfokú vesztéséhez vezet a nyitott Ins(1,4,5)P3-receptorokon keresztül. Ilyen mértékű PLC aktiváció a Gq-fehérjéhez kapcsolt 7-TM receptorok, a tirozin-kináz receptorok, illetve a nem receptor tirozin-kinázok aktivációjakor figyelhető meg (143).

A folyamat során az ER Ca²⁺-tartalmának csökkenését a STIM-1 és -2 fehérjék érzékelik. Szerkezetüket tekintve a STIM fehérjék három részből állnak: egy citoplazmába nyúló C-terminális régióból, egy egyszeres transzmembrán-doménből, melyekkel a protein az ER membránjába ágyazódik, és az N-terminális Ca²⁺-kötő doménből, amely az ion megkötésére alkalmas, jellegzetes EF-kéz motívumokat tartalmaz (144). A STIM fehérjék két izoformájánál, tehát a STIM-1-nél és a STIM-2-nél a legnagyobb különbség ebben az utóbbi régióban van. A STIM-2 molekula azonos régiója jóval kisebb affinitással köti a Ca²⁺-ionokat, ezért jóval kisebb raktárürülést is érzékelni képesek, mint ahogyan azt a STIM-1-nél tapasztalható (145). Ennek a jelentősége a két fehérje eltérő működésében is megnyilvánul, ugyanis a STIM-2 fehérje a sejtek nyugalmi Ca²⁺-háztartásának (146), és a raktárak töltöttségi állapotának fenntartásáért felel, míg a STIM-1 fehérje fő funkciója a jelentős Ca²⁺-felszabadulással járó állapotok után a raktár újratöltésében rejlik, tehát a klasszikus értelemben vett SOCE mechanizmusa sokkal inkább ehhez az izoformához köthető. További érdekesség, hogy a Ca²⁺-érzékelést végző luminális domének az EF-kéz motívumon kívül még tartalmaznak egy hidrofób aminosavakból álló α-hélix struktúrát is, melyeken keresztül a fehérjék oligomerizálódhatnak az EF-kéz domén Ca²⁺-kötésének megszűnésekor

létrejövő konformációváltozást követően (147). Ennek az oligomer-képzésnek ugyancsak fontos szerepet tulajdonítanak, mivel ilyenkor jön létre a molekula citoplazmatikus C-terminális részének a konformációváltozása, amely később a PM-ban található Orai fehérjékkel alakít ki interakciót (148). A folyamat során a STIM fehérjék a tubuláris ER-szakaszokról az ER-PM között kialakuló kontaktpontokba vándorolnak, ahol a két orgenellum között lévő hozzávetőlegesen 13 nm-es távolság áthidalása után (149), megtörténik az Orai és STIM1 fehérjék kapcsolata (6. ábra).

6. ábra A STIM1 és Orai1 fehérjék kapcsolódásának folyamata a SOCE aktiválódása esetén, forrás (150) A SOCE folyamata az ER-nak, mint raktárnak az ürülésével veszi kezdetét, melyet a STIM1 fehérje luminális EF-doménjei regisztrálnak. Ezek után elkezdődik a STIM1 fehérjék dimerizációja majd oligomerizációja, melyben az ugyancsak luminális SAM doménnek van kiemelt jelentősége. Ezzel párhuzamosan a fehérje citoplazmatikus része

„kinyílik”, így szabaddá válnak a CAD doménjei, amely később az Orai1-hez kapcsolódik és aktiválja a fehérjét. A SOCE aktiválódásának további feltétele a STIM fehérjék kontaktpontokba való vándorlása és stabilizálása, melyben a fehérje PBD doménjei vesznek részt a PM negatív töltésű lipidjeinek, például a PIP2-nek a kötésével. A folyamat végén a hasonlóan besűrűsödött Orai1 fehérje és a STIM1 között kialakul a direkt kapcsolat és létrejön kálcium-áram.

Az Orai fehérjék 4 transzmembrándoménnel rendelkeznek, és mind az N-, mind a C-terminális szakaszuk intracellulárisan helyezkedik el (151). A két fehérje kapcsolódásában szerepet játszó molekularészleteket mindkét fehérje esetében többen, részletesen vizsgálták. Úgy tűnik, hogy mind a két fehérje részéről a C-terminális szakaszoknak van kiemelt jelentősége a molekulák kezdeti kapcsolódásában, míg az Orai fehérjék N-terminális részének pontos szerepét még nem ismerik, de feltételezik, hogy a kapcsolat stabilitásának erősítéséért, vagy a csatorna kapuzási mechanizmusáért felel (152-154). A két fehérje kapcsolódási mechanizmusának részletesebb megismerése érdekében, illetve a minimálisan elegendő molekularészletek meghatározásához, amely még elégséges a két molekula kapcsolódásához számos vizsgálat készült. Ezekben mutációkat, és trunkált szakaszokat tartalmazó STIM1 fehérjéket használtak. Az

eredmények alapján egyértelműen látszik, hogy a fehérje C-terminális SOAR doménjének megléte szükséges, és elégséges feltétele a funkcionálisan aktív csatornaműködéshez, ugyanis a fehérjedarab tranziens expressziója esetén konstitutívan aktív Ca²⁺-áramot tapasztaltak (152,155). Fontos azonban megjegyezni, hogy sem az Orai fehérje, sem az ily módon megrövidített STIM1 fehérje nem képes a PM-ER kontaktpontokban felhalmozódni, habár oligomerizációra így is képes, ami bizonyítja, hogy a folyamathoz ez a molekularészlet nem járul hozzá (156). Abban az esetben, ha a STIM1 fehérjék tartalmazzák a C-terminális végen elhelyezkedő polibázikus fehérjeszakaszt (PBD, 6. ábra), akkor lehetővé válik a fehérje dúsulása önmagában is, amely a domén kiemelt jelentőségére mutat rá (157). Feltehetően a STIM fehérjék ennek a segítségével képesek a kontaktpontok megtalálására, ugyanis, ha a PM közel helyezkedik el az ER-ban történő diffúziójuk során, akkor a polibázikus részek megkötik a PM negatívan töltött foszfolipidjeit és stabilizálják a fehérjét, míg az Orai-val történő kapcsolat be nem következik.

Ennek a folyamatnak a valószínűségét növelik azok a vizsgálatok, melyekben a polibázikus régiók lipidkötését vizsgálták liposzómák segítségével. A kísérletek során azt tapasztalták, hogy a STIM1 fehérje polibázikus régiója csak dimer, vagy tetramer formában kötötte a PM-ban nagy mennyiségben megtalálható PtdIns(4,5)P2-ot, míg a STIM2 fehérje azonos szakasza már egyedi molekulaként is nagy kötéserősséggel bírt (158). Egy további vizsgálatban élő sejteken is vizsgálták a PM PtdIns(4,5)P2 és PtdIns(3,4,5)P3 tartalmát a SOCE működésével összefüggésben, és a lipidek csökkentésekor nem jött létre a fehérjék dúsulása kontaktpontoknak megfelelően, illetve a csatornán keresztüli áram is megszűnt (159). Ezeken kívül a PM PtdIns4P tartalmának szerepére utaló közleményt is találhatunk az irodalomban (160). A felsoroltakból is jól látható, hogy a PM töltéseit biztosító lipideknek a szerepe még nem egyértelműen bizonyított a folyamatban, ezért munkám egyik céljaként a folyamatban szereplő lipidek vizsgálatát tűztem ki, melyek eredményeit az Eredmények c. fejezetben mutatom be részletesen.