A PAGE módszerről általában

Mint fent már korábban említettük, a poliakrilamid gélt kisebb nukleinsavak elválasztásánál is alkalmazzák. A Sanger-féle DNS szekvenálás esetében például ezzel a módszerrel választják el egymástól az eltérő hosszúságú, lineáris, egyszálú DNS molekulákat. Az eljárás felbontása a néhányszor 10-bázis hossztól a nagyjából 1000 bázis hosszúságig terjedő mérettartományban olyan nagy, hogy képes az egymástól csak 1-1 bázis hosszal eltérő molekulákat is elválasztani. DNS esetében tehát egyértelműen a lánc hossza szerint zajlik az elválasztás. Ennek az az oka, hogy a DNS (és RNS) estében az egységnyi molekulatömegre (polimer-hosszra) eső negatív töltések száma, vagyis a relatív töltés azonos. Ez annak köszönhető, hogy minden monomer egység tartalmaz egy foszfátcsoportot, ami a negatív töltést hordozza. Megfelelő denaturálószer (pl. urea) alkalmazása mellett a lineáris molekulák alakja is azonos lesz. Így kizárólag a denaturált molekula mérete szerint válnak majd el egymástól.

(Ugyanezt látjuk majd az SDS-PAGE esetében fehérjék vonatkozásában, lásd később). A PAGE módszernek azonban számos olyan változata van (SDS-PAGE, izoelektromos fókuszálás, 2D PAGE), amelyek elsősorban fehérjék különböző tulajdonságok szerinti elválasztására alkalmas.

A különböző fehérjék egy adott pH értéken más-más töltéssel rendelkeznek. Ráadásul az egyes fehérjék mérete és alakja is eltérő. Ha vizes oldatban elektromos erőtér alkalmazásával a fehérjéket vándorlásra késztetjük, az egyes fehérjék eltérő töltésük, méretük és alakjuk miatt különböző sebességgel mozognak, és ez alapján egymástól elválaszthatók. Mivel az elválasztás egyszerre többféle elven zajlik, ezért ugyan nagyhatékonyságú, de pusztán egy-egy elválasztás alapján nem tudjuk meghatározni, hogy egy adott fehérje miért vándorol gyorsabban egy másiknál: elsősorban azért, mert nagyobb a töltése, vagy azért, mert kisebb a mérete. A fent már említett, később ismertetendő PAGE változatokat éppen azért fejlesztették ki, hogy a fehérjék kizárólag méret, vagy éppenséggel kizárólag izoelektromos pont alapján váljanak el (lásd később).

A poliakrilamid gél létrehozása: az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagy molekulatömegű, lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Mivel az akrilamid rákkeltő és mutagén, alkalamazásánál megfeelő óvatosság szükséges. A polimer forma azonban már nem mérgező. Ez utóbbi vizes oldata nagy viszkozitású. Ha megfelelő keresztkötő ágenst, N,N’-metilénbiszakrilamidot is alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre (7.2 ábra). Az elektroforézis során az ionokat (nukleinsavakat vagy fehérjéket) ebben a gélben vándoroltatjuk.

7.2. ábra. A poliakrilamid gél molekuláris felépítése. A térhálós gél poliakrilamid monomerek és N,N’-metilénbiszakrilamid keresztkötő komponensek gyökös polimerizációjával jön létre.

Mint arról már szó esett, az eljárás különlegesen nagy felbontóképességgel rendelkezik, a gélben a molekulák sebességére töltésük, méretük, illetve alakjuk is befolyással bír. A gél méret szerinti „molekulaszűrő” hatását a gél átlagos pórusmérete szabja meg. A pórusméret az akrilamid monomer koncentrációjának és a térhálósító metilénbiszakrilamid százalékos arányának alkalmas megválasztásával tág határok között változtatható. A gél mechanikus tulajdonságai kb. 4-20% akrilamid koncentráció-tartományban kedvezőek. A keresztkötő metilénbiszakrilamid mennyisége az alkalmazott akrilamid monomernek rendszerint 1-3%-a. A poliakrilamid rendelkezik mindazon már említett tulajdonságokkal (hidrofil, nem hordoz töltéseket, kémiailag stabil), amik az elektroforézis során előnyösek. Ezeken felül további fontos tulajdonsága, hogy az elválasztandó fehérjékkel nem lép semmilyen fehérje-specifikus kölcsönhatásba, és nem zavarja a fehérjék detektálására szolgáló festési reakciókat sem. Ha az elektroforézist natív (nem-denaturáló) közegben, alacsony hőmérsékleten végezzük, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók.

Gélkészítés során az igény szerinti koncentrációjú akrilamid / metilénbiszakrilamid oldathoz megfelelő pH értékű pufferoldatot keverünk, majd a gyökös polimerizációt egy alkalmas katalizátor és iniciátor hozzáadásával indítjuk el. A katalizátor általában peroxidszulfát, mely vizes közegben spontán bomlik, ami által szabad gyökök keletkeznek.

Ezek a szabad gyökök azonban önmagukban nem képesek az akrilamid molekula kettős kötését felhasítva elindítani a gyökös polimerizációt, viszont gerjesztik az iniciátor molekulákat. Ez utóbbiakból ekkor olyan szabad gyökök alakulnak ki, amelyek már kiváltják a polimerizációt. A leggyakrabban használt iniciátor a tetrametil-etilén-diamin (TEMED). A katalizátor és az iniciátor koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a polimerizáció, így a gélesedés 10-30 perc alatt teljes mértékben végbemenjen.

Az elektroforézis "geometriája" szerint kétféle eljárás használatos. Az elsőként kidolgozott módszer esetében a pufferrel, katalizátorral, iniciátorral összekevert akrilamid / metilénbiszakrilamid oldatot egy az egyik végén lezárt üvegcsőbe öntik. Az így létrejövő géloszlopban csak egyetlen mintát lehet futtatni. A jelenleg elterjedt eljárásokban a fent említett oldatot két, egymással párhuzamos üveglap közé töltjük (7.3. ábra). Így egy gél lemez alakul ki, amelyben egyidejűleg, egymás mellett, azonos körülmények között számos mintát futtathatunk, melyek ily módon egymással könnyen összehasonlíthatók. Ez nagyban megkönnyíti az elektroforézis eredményének kiértékelését.

7.3. ábra. Fehérjék elválasztása poliakrilamid gél lemezben. Amint azt az ábra mutatja, az elektroforézis készülékben párhuzamosan több mintát is vándoroltathatunk egyetlen gél lemezben. A katód és az anód között csak a gélen

keresztül vándorolhatnak az ionok. A gél molekulaszűrőként viselkedik, minél nagyobb a vándorló molekula, annál jobban akadályozza a gél annak mozgását.

Az elektroforézis sikerét döntő mértékben befolyásolja a gél akrilamid koncentráció és a pH helyes megválasztása.

Fehérjék esetén rendszerint az izoelektromos pontnál magasabb pH-n dolgozunk. Ekkor a fehérjék negatív töltésűek, így az anód felé vándorolnak. A puffer szerepe nemcsak abban áll, hogy az elektroforézis ideje alatt a pH-t állandó értéken tartja, hanem a puffer ionjai végzik az áram vezetés legnagyobb részét is. Normális esetben a fehérjeionok az áram vezetésében csak elhanyagolható mértékben vesznek részt, vagyis a fehérjék átviteli száma kicsi. Ha azonban a puffer koncentrációja túl alacsony, megnő a fehérjék szerepe az áram vezetésében, ami általában elkenődött fehérjesávokat eredményez. Az optimálisnál magasabb puffer koncentráció esetén viszont túl kicsi lesz a fehérjék mobilitása, ami szintén rontja az elválasztás minőségét, mivel a megnövekedett időigény miatt a diffúzióra is több idő jut.

Az alkalmazott puffer rendszerek szempontjából a gélelektroforetikus technikákat két nagy csoportba oszthatjuk.

Folytonos (kontinuus) puffer rendszerről beszélünk, amikor ugyanazt a puffert alkalmazzuk a gélben, mint az elektródokat tartalmazó puffer-tankokban. Ennek a módszernek az előnye az egyszerűségében rejlik, viszont a felbontóképessége valamivel rosszabb, mint a bonyolultabb ún. diszkontinuus puffer rendszereké.

A diszkontinuus elektroforetikus technikák két különböző koncentrációjú gélt, és három különböző puffer rendszert alkalmaznak. A futtató (más néven szeparáló) gél fölé egy ún. koncentráló (más néven: tömöritő) gélt polimerizálunk.

Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, olyannyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A három különböző puffer rendszerben két különböző aniont alkalmaznak. Mindkét gélben a puffer anion komponense egy erős sav maradéka, melynek disszociáció foka gyakorlatilag nem függ a közeg pH-jától, vagyis töltése széles pH tartományban állandó. Ez a komponens általában a kloridion. Tank pufferként viszont olyan puffer rendszert alkalmaznak, melynek anion komponense egy gyenge sav savmaradéka, pl. glicinát anion. A tankpufferben a pH 8.3.

A kistérfogatú fehérjemintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérjeionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a pH 6.8, ami alig magasabb, mint a glicin izoelektromos pontja (6.5). Ilyen pH-n a glicin molekula csak parciálisan negatív (az idő nagy részében nettó semleges ikerionos állapotban van), elektroforetikus mobilitása alacsony, így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. Ez helyileg megnöveli az elektromos ellenállást. Minthogy az elektromos körben az áramerősség állandó kell, hogy legyen, (nincs makroszkopikus töltésszétválás), Ohm törvényének megfelelően az ellenállással arányosan megnő a térerő is, ezért a fehérjék vándorlása felgyorsul, amíg el nem érik az ionokban gazdag, kis elektromos ellenállású klorid ion frontot. Minthogy a klorid ion frontban az ellenállás, és így a térerő kicsi, a fehérjék sebessége csökken, és a front mögött mintegy összetorlódva igen vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig.

A futtató, vagy más néven szeparáló gélben a helyzet megváltozik. A szeparáló gél pH értéke 8.8-9.0 között van.

Ezen a pH-n a glicinben lévő aminocsoportok egy része elveszti az extra protonját, így elveszti a pozitív töltését.

A glicinát ion parciális negatív töltése emiatt megnő, ezért mobilitása is megnövekedik. Így a glicinát töltéshiányából eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző töltésük miatt eltérő sebességgel

vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon méret szerint is.

Az elektroforetikus eljárások többségénél a futtatás során jelzőfestéket alkalmazunk, amit a mintába keverünk. Ez a kis molekulatömegű, negatív töltésű festék rendszerint gyorsabban vándorol a gélben, mint az elválasztandó makromolekula-ionok (pl. fehérjék). A festék mintegy láthatóvá teszi a futási frontot, így egyértelművé válik, mikor tekinthető az elválasztás befejezettnek. A leginkább használatos jelzőfesték a brómfenolkék.

A továbbiakban ismertetjük az egyes PAGE eljárásokat, a legegyszerűbbtől az egyre összetettebb felé haladva.