Matrigel technika

4.7 Matrigel technika

Az agaróz alapú technikákhoz sokban hasonlít az 1980-as évek közepe táján bevezetett és többek között a BD Biosciences által forgalmazott anyag, mely az előző fejezetben tárgyaltnál lényegesen jobban modellezi a magasabb rendűek szöveti környezetét, s így egyes migráció vizsgálatokra is sokkal megfelelőbbnek bizonyult [60, 61, 62]. A gél alapanyaga egér Engelbreth-Holm-Swarm szarkómából izolált s extracelluláris matrix fehérjékben gaz-dag. A fő komponensei a laminin, IV-es típusú kollagén, entaktin, heparin-szulfát és proteoglikán. Fentiek mellett több enzim (pl. kollagenáz) és más a migráció szempontjából is fontos szabályozó funkciót betöltő molekula (pl.

plazminogén aktivátor), valamint számos, növekedési faktor (4.1 táblázat) található meg a keverékben a biológiai hatás elérése szempontjából számot-tevő koncentrációban.

Növekedési faktor Koncentráció Matrigel-ben

GFR – növekedési faktor szint csökkentett; n.d. – nem detektálható

4.1 táblázat A Matrigel-ben található növekedési faktorok hozzávetőleges

koncent-A fentiekben már felsorolt extracelluláris matrix komponensek közül a laminin és a kollagén tekinthető a Matrigel domináns összetevőjének s ezek aránya a speciális célokra készített, növekedési faktorokat csak csökkentett mennyiségben tartalmazó Matrigel-ben sem változik lényegesen (4.2 táblá-zat).

GFR – növekedési faktor szint csökkentett

4.2 táblázat Bazális membrán fehérjéinek aránya Matrigel-ben (BD Bioscience – Matrigel).

Az összetételében a bazális membránt modellező Matrigel számos kísérlet vivőközegéül szolgálhat. Membránok bevonásával ú.n. kétdimenziós rend-szerekben segíthet ahhoz, hogy a vizsgált sejtek migrációs aktivitását az in vivo környezethez közeli állapotban elemezzük. Ebben a dimenzióban alkal-mazzák endotél monolayereken az angiogenezis kezdeti fázisának tanulmá-nyozásában is, jól vizsgálhatók benne a kialakuló kapillárisok és azok háló-zatai. Nagyobb rétegvastagságokat alkalmazva már a háromdimenziós vizs-gálatok egyik leggyakrabban alkalmazott alapanyaga a Matrigel, melyben

Az eddig felsorolt felhasználási lehetőségek komoly gátját jelenti, hogy a fe-jezet elején felsorolt összetevők mellett számos nem definiált komponens is található a Matrigel-ben. Ez a bizonytalansági tényező szab mind a mai napig határt az ezen az anyagon végezhető vizsgálatoknak több területen (pl.

gyógyszer-fejlesztés) is.

Gyakorlati útmutató 16 Matrigel technika (3D)

Célsejt amőboid mozgást végző sejtek (endotél, fibroblaszt, neu-ron, tumoros sejtek)

Anyagigény Matrigel, vizsgálandó anyag, pufferek

Egyéb eszköz Petri-csésze

Kiértékelés / Speciális eszköz fénymikroszkóp

Kivitelezéséhez szükséges idő sejt-típustól függően 3-5 nap – 2 hét Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvalitatív > kvantitatív

Fő előnye/hátránya szöveti környezetet jól modellezi

Egyéb különös óvatossággal kell eljárni a gél készítésénél (ld. idő előtti polimerizáció elkerülése) és a sejtek gélbe keverése-kor

Ref. 62

A Matrigel technika már lehetőséget nyújt a migráló sejtek és nagyobb sejt populációk vizsgálatára kísérleti állatban is. A korábban említett technikai és elméleti limitáló tényezők (ld. a hőmérsékletre érzékeny szilárdulás, illetve a készítmény gyártásisorozat-függő, növekedési faktorbeli eltérései) ellenére, gyakran alkalmazott technika különösen az erek képződését, illetve újrakép-ződését vizsgáló in vivo kísérletek során.

4.7.1 Aorta-gyűrű technika

A címben jelzett eljárás még csak átmenetet jelent az in vivo és in vitro kí-sérletek között [63]. Lényege az, hogy kísérleti állat nagyartériájából, legcél-szerűbben az aortájából készítünk szeleteket, melyeket fiziológiás só

oldat-extracellulársi matrix komponenseket tartalmazó anyaggal bélelt, 24-48 lyu-kú szövettenyésztő lemezek aljára helyezzük. Ezt követően, 30 perc várako-zási idő után az érdarabokat 100-100 l Matrigel-lel fedjük. Egy ismételt 30 perces várakozás után a gélek megszilárdulásával kialakul a kívánt rendszer, melyet kb. 500 l RPMI és 50 l FBS hozzáadásával teszünk a sejtek növeke-dése szempontjából optimális összetételűvé. A kísérlet kontrolljaként FBS mentes minták beállítása is ajánlott (4.20 ábra).

4.20 ábra Aorta gyűrű technika kivitelezésének főbb lépései.

Ezt követően a tenyészetet 37 ºC-on tartjuk, az RPMI tenyésztő médiumot naponta cseréljük. A kísérlet kiértékelése a 4.-6. (-14.) napon történik. Ekkor az aorta gyűrűből kivándorló endotél és egyéb sejtes elemek mennyisége,

szerű fénymikroszkópos technikák mellett egyre gyakrabban alkalmaznak komputerasszisztált morfometriai eljárásokat.

Az elmúlt évek során e technika egy módosított változatával sikerült a jelen-tős (4-14 napos) vizsgálati időtartamot lecsökkenteni [64]. A módostítás 12-14 napos csirke embriók aortaívéből készített szeleteket alkalmaz. Így a Matrigel-re helyezett mintákban már kb. 48 óra múlva érszerű struktúrák kifejlődése észlelhető. Tovább gyorsítható a technika az gyűrűk kifordításá-val, ekkor már kb. 24 óra múlva megjelennek az angiogenezisre utaló tubuláris elemek.

4.7.2 Matrigel-plug technika

Ezek között is talán a leggyakrabban alkalmazott az ú.n. Matrigel plug mód-szer (4.21 ábra), melyben a kísérleti állat bőre alá injektálunk kis mennyiségű (kb. 0.2-0.5 ml) Matrigelt, illetve abban elkevert vizsgálandó anyagot (pl. ér-képződést elősegítő vagy gátló gyógyszerek) [65]. Igen gyakori az angiogenezist elősegítő 0.1-1 g/ml bFGF hozzáadása a gélhez. A kísérlet tartama kb. (5)-10-14 nap, mely végeztével a polimerizálódott géldarabkát szöveti környezetével egyetemben távolítjuk el az állat testéből. A kiértékelés eszköztára nagyon széles, a legalapvetőbb szövettani technikák felhasználá-sától a számítógépes analízisig terjed.

A vizsgálatok során jól elemzhető a Matrigel-ben bejuttatott és onnan foko-zatosan felszabaduló anyagok angiogenezisre gyakorolt hatása éppúny, mint a kísérleti állatok egyéb kezeléseinek érképződést befolyásoló jellege.

4.21 ábra A Matrigel-plug technika főbb lépései.

4.7.3 Matrigel-kapszula technika

Szintén a Matrigel-t felhasználó módszer, amikor az előzőekben ismertetett-hez képest jobban körülhatárolt térben, egy szövetbarát és allergiás reakció-kat ki nem váltó anyagból készült gyűrűvel határolt térben helyezik el a Matrigel-ben elkevert anyagokat [66]. A módszer leírói a gyűrű két oldalát eltérő vastagságú nylon filterrel fedik. Ez egyrészt módot ad az anyagok sza-bad kiáramlására a kapszulából, azonban a sejtek bevándorlását csupán a vékonyabb oldal felől teszi lehetővé (4.22 ábra).

A kapszulák behelyezésére azok fertőtlenítése után kerül sor, rendszerint a kísérleti állat testének oldalán ejtett metszést követően. A subcutan

elhelye-4.22 ábra Matrigel-kapszula szerkezete és a technika főbb lépései.