Filteren keresztüli migráció

Ezeknek a próbáknak közös tulajdonsága, hogy a sejteknek az attraktáns irányába egy filteren kell aktív mozgással áthaladni. Tehát a filter pórusának átmérője eleve kisebb kell, hogy legyen a vizsgálni kívánt sejtek jellemző méreténél, és a pórusok filtert átjáró szakaszai rendszerint nem merőlegesek a filterlemez szintjére, hanem avval szöget zárnak be, evvel is biztosítva, hogy csak az aktív amőboid mozgást végző sejtek átjutását értékeljük az assay befejeztével.

A filtereket kezdetben cellulóz-észterből készítették. Már ezek a viszonylag vastag (100-150m) lemezek is eltérő pórusmérettel készültek biztosítva ezzel a különböző méretű sejtek differenciált vizsgálatát. A polikarbonát tí-pusú filtereket az 1970-es években vezették be a kemotaxis vizsgálatokba.

Ennek több előnyös tulajdonsága is volt a cellulóz-észter filterrel szemben.

Ez a filter jelentősen vékonyabb (kb. 6-10m), így annak mindkét oldalán nagyon rövid időn belül azonos koncentráció alakul ki. Az áthaladás a poli-karbonát filteren a sejtek 2D felszínhez való adhéziós képességétől függ, szemben a cellulóz filterrel, melyben 3D mátrix szerint jutnak át a sejtek.

Újabban, a kísérletek pontossága, illetve az élettani viszonyok jobb modelle-zése érdekében a polikarbonát filtereket különböző anyagokkal, illetve sejt-rétegekkel is bevonják. Ilyen lehet a citokinek által aktivált endotél (pl.

HUVEC = human umblical vascular endothelial cells), melyet általában a kü-lönböző fehérvérsejtek és tumorsejtek vizsgálatánál használnak. Így nemcsak az adott attraktáns, vagy repellens anyag hatásai mutathatók ki, hanem az is megfigyelhető, hogyan hatnak a különböző extracelluláris mátrix elemek, citokinek, esetleges gyulladásos mediátorok, adhéziós molekulák a kemota-xisra. Egyes összetettebb technikák már a szöveti térben mérhető áramlást is modellezni képesek és így még pontosabb eredmények elérése lehetséges.

4.4.1 Kétkamrás eljárások

A sejtek filteren keresztüli gradiens irányú mozgása vizsgálható ezekkel a módszerekkel, azonban itt már az egyes kamrák elkülönítése nem csupán virtuális (ld. kapilláris módszerek), hanem azokat a filter valóban két jól el-különíthető térrészre osztja. A leggyakrabban alkalmazott leukocita kemota-xist vizsgáló assay-k tartoznak ide. Egyaránt alkalmazzák ezeket eddig nem karakterizált sejtek és új kemotaktikus ligandok vizsgálatakor. A berendezés eredetileg csak egy filtert magába foglaló üveg vagy műanyag üvegcséből állt (ez a klasszikus Boyden kamra). Később ebből az egyszerű eszközből fejlőd-tek ki a sok kamrát tartalmazó rendszerek, amelyek már gyorsan, nagy sejt-populációk vizsgálatára is képesek.

4.4.1.1 Boyden kamra

Boyden 1962-ben vezette be a használatát (4.5 ábra). Azóta sok módosított változata került forgalomba. Boyden kezdő kísérleteiben egy 150 m vastag cellulóz-észter membránt használt 3m-es pórus átmérővel, ez választotta el a felső és alsó kamrát. A vizsgálni kívánt anyag oldatát az alsó, a leukoci-tákat a felső kamrába, a membrán filter tetejére helyezte. Ezután 1-4 órán keresztül 37 ºC-on inkubálta a rendszert, majd az alsó kamrában található sejteket megszámolta. Ez az eljárás képes volt a használt anyag kemotaktikus hatásának gyors meghatározására. Boyden azonban úgy ta-pasztalta, hogy néhány sejt akkor is átjut a filteren, ha nem használ kemotaktikusan aktív anyagot. Ezt a hibát kiküszöbölendő először egy a sej-tek számára áthatolhatatlan filtert használt, amely indukáló anyag hiányában is a „lecsorgó” sejteket mintegy csapdába ejtette. Ezeket megszámolva és ennek értékét az attraktáns anyagra kapott eredményből kivonva már ponto-sabb eredményhez jutott. A gyakorlati felhasználás szempontjából nehézkes eljárás tökéletesítésére és a nem kívánt háttérhatásból adódó hiba csökken-tésére a későbbiekben az inkubációs idő lerövidítése is jó megoldásnak bi-zonyult, nem is beszélve a filterbe migrált sejtek számának mikroszkópos úton történő meghatározásáról.

Bár tudnunk kell, hogy „Boyden-kamrát” igen egyszerű eszközök segítségé-vel, házilagosan is előállíthatunk (ld. gyógyszeres fiolák műanyag záróku-pakjait egymás felé fordítva is képezhetünk filterrel elválasztott kamrákat, jól reprodukálható mérések gyárilag előállított kamrákban végezhetők meg-nyugtató pontossággal. Ilyen gyári módosításnak köszönhető a kamra továb-bi tökéletesítése is, melynek során több változtatás is történt. Ezek közül

ta-lán a mérések megbízhatósága szempontjából legfontosabb az a kis csatorna mely a filter alsó felszínén esetlegesen felgyülemlő levegőbuborékok elveze-tésére szolgál (ld. NeuroProbe által forgalmazott kamrák). Ezáltal az attraktáns közeg és a sejtes minta közötti érintkezési felszínen a számított elméleti értékek könnyen reprodukálhatókká váltak.

A Boyden kamra kedvező tulajdonságai melletti egyik nagy hátránya, hogy relatíve nagy mennyiségű kemotaktikus ligandumot, és nagyszámú sejtet kí-ván. (Az eredeti Boyden kamra mintegy 1.5 ml ligandumot tartalmazó oldat-tal és 5x10⁶ sejttel működött.) Problémát jelenthet továbbá, hogy a párhu-zamos futtatások végzésére sem kifejezetten alkalmas az egyedi kamra, igen megterhelő annak szétszerelése, mosása szárítása stb. az egyes inkubációk között.

4.5 ábra A Boyden kamra leegyszerűsített vázlata.

A kamra fent jelzett hátrányait kikerülni igyekezve, Falk és munkatársai nagy szerepet játszottak a transwell és sokkamrás assay kifejlesztésében, melyek a napjainkban is használt ú.n. „multiwell” assay-k előfutárai voltak.

sejtek festése/számlálása

Kivitelezéséhez szükséges idő inkubációs idő kb. 1-4 óra (max. 24 óra) Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvantitatív

Fő előnye/hátránya nagy anyag igény, a párhuzamos vizsgálatok sok eszközt igényelnek

Egyéb -

Ref. 50

4.4.1.2 Transwell rendszerek

A Boyden kamra széles szakmai körben aratott sikerének is köszönhető volt, hogy az 1980-as években egyre jobban elterjedtek azok a kemotaxis méré-sére alkalmas eljárások, melyek gyárilag előállított, steril, egyszer használa-tos műanyag külső kamrákból és a felhasználó által szabadon választható filterrel felszerelt belső, kosárka alakú tartályból állnak. A Boyden kamrához hasonlóan a sejtek a felső kamrába, míg a hívó jelet tartalmazó folyadék az alsó tartályba kerül (4.6 ábra). A módszer – a kamrák viszonylag nagy térfo-gatából adódóan -, éppúgy alkalmas a vizsgálat során termelődő és a kemo-taxist feltételezetten befolyásoló anyagok izolálására, mint az alsó kamrába vándoroló sejtek szelekciójára és továbbtenyésztésére. Egymástól eltérő in-kubációs idejű vizsgálatok elvégzésére szintén jól alkalmazhatók a transwell rendszerek, mivel a belső tartályok nem csak összefüggő lapokban, de so-rokban és egyesével kiszerelve is beszerezhetők.

A klasszikus kemotaxis kísérletek kiértékelése ezekben a rendszerekben ha-sonló a fentiekben már említettekhez: az alsó kamra folyadékterének sejt-száma, valamint a filterbe migrált sejtek számának meghatározása egyaránt használatos.

4.6 ábra Transwell rendszer vázlatos elrendezése, valamint filterbe migrált sejtek mikroszkópos detektálása festést követően.

A módszer fentiekben felsorolt előnyei (pl. felhasználóbarát elrendezés, vi-szonylag nagy számú sejt szelekciója) mellett, kétségtelenül problémát jelent a külső és belső tartályban elhelyezett folyadékterek közlekedőedény-szerű kapcsolódása. Ez különösen akkor jelent gondot, ha a filtert sem peptidek, sem endotél réteg nem fedi. Ekkor ugyanis a külső és belső folyadékszintek eltérése esetén egyaránt mód van a belső tartályban elhelyezett sejtmentes állomány fokozott ütemű kijutására (a külső tér anyagainak koncentrációja hígul), illetve az attraktáns visszaáramlása révén a koncentráció gradiens

sé-külső- és belsőkamra térfogatokat ajánljanak, melyek betartásával a fent jel-zett problémák elkerülhetők.

Gyakorlati útmutató 7 Transwell assay (3D)

Célsejt eukarióta amőboid mozgást végző sejt 10⁵-10⁶ sejt/ml

Anyagigény vizsgálandó anyag, pufferek

Egyéb eszköz filterrel ellátott műanyag inzert; 6-12-24 lyukú lemez Kiértékelés / Speciális eszköz átvándorolt sejtek száma/filter kiértékelése

fénymikroszkóp

Kivitelezéséhez szükséges idő sejt-típustól függően 30 min.-3 óra Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvantitatív

Fő előnye/hátránya könnyű kezelhetőség / folyadékszintek pontos beállítása Egyéb

Ref. 51

4.4.1.3 Sokkamrás – multiwell – assay

Az első sokkamrás rendszer 48 kamra egységből épült fel. Egy alsó és egy felső lemezből áll, amelyek a kamrákat tartalmazzák, és ezeket egy filter vá-lasztja el. A napjainkban rendelkezésre álló formák már 96 vagy 384 kamrát is tartalmazhatnak (4.7 és 4.8 ábrák).

4.7 ábra A módosított Boyden kamra rajza

4.8 ábra A NeuroProbe által gyártott, módosított Boyden kamra képe.

Mint azt a 4.7 ábra mutatja ebben egy 96-lyukú lemez szolgál az alsó, kemoattraktánst tartalmazó kamraként. A felső, sejtek betöltésére szánt kamrát

ta-padó anyaggal bevont kerettel ellátott filter választja el az alsó résztől.

(http://www.neuroprobe.com/products/mbseries.html)

A sokkamrás assay-kben csökkenteni lehetett a felhasznált ligandok meny-nyiségét, valamint a sejtek számát is. A döntő különbséget az egykamrás Boyden kamra és a sokkamrás assay-k között a filter anyaga jelenti, mivel a sokkamrás assay-k már kizárólagosan polikarbonát filtereket használnak.

Annak ellenére, hogy alkalmazásuk viszonylag könnyű, számos ellenvetés hangzik el a sokkamrás assay-k ellen is, főként akkor, ha a feladat a kemo-taxis és a kemokinezis elkülönítése.

Ez utóbbi célra a checkerboard analízis elvégzése ajánlott, amely a filteren átvándorló sejtek által megtett útról készít vázlatos rajzot. A checkerboardon végzett kísérletben a kemoattraktáns anyagot a filter alatt és felett

különbö-illetve a koncentrációgradiens nagysága között. Ha a koncentrációgradiens meredeksége és az átvándorló sejtek száma között erős pozitív korreláció figyelhető meg, akkor a sejtek kemotaktikus válaszáról beszélhetünk (a koncentrációgradiens irányába migrálnak a sejtek). Ezzel szemben, az anyag mennyisége és az átvándorló sejtek száma között kimutatható csekély korre-láció kemokinezist valószínűsít (növekszik a sejtek random elmozdulásának sebessége és ez azt eredményezi, hogy a sejtek az alsó kamrában halmo-zódnak fel). Bár ez az analízis egy ésszerű elméleti lehetőséget ad a kemota-xis és kemokinezis elkülönítésére, de a gyakorlatban nem használható telje-sen hibamentetelje-sen, mivel az elméletben feltételezett lineáris koncentráció gradiens tökéletes formában kivitelezhetetlen. Mint azt korábban is említet-tük már: a gradiens mind térben, mind időben változni fog. A módszer csak akkor használható, ha képesek vagyunk a kemoattraktáns anyag koncentrá-cióját a sejtek környezetében szigorúan kontrollálni. (Ugyanezen megfonto-lások alapján a sokkamrás assay-k eredményeinek pontossága sem tekinthe-tő mindig megfelelőnek.)

Egy másik probléma, ami felmerül a filteren keresztüli migrációt vizsgáló assay-k esetében: annak hiánya, hogy az eljárás nem tud különbséget tenni a különböző sejtmozgások között. Egyes esetekben nehéz ellenőrizni, hogy az inkubációs idő alatt hány sejt halmozódik fel a koncentráció gradienstől füg-getlenül az alsó kamrában. A kemoattraktáns anyagok koncentrációgradiense az idő függvényében alakul ki és változik, ezért a kemoattraktáns anyagok által kiváltott különböző mozgások is ezzel együtt változnak. Például a kemokinezis a kemoattraktáns stimulus után lényegében azonnal kialakul, míg a kemotaxis kifejlődésére várni kell amíg a tényleges

koncentrációgradiens ki nem alakul. Utóbbi eltarthat néhány perctől akár órákig is. Ezért ha korai időpontban vizsgáljuk a filteren keresztül átvándo-rolt sejteket, akkor a sejtek kemokinezisére kifejtett hatást vizsgálhatjuk, míg egy későbbi időpontban már a kemotaxis válik meghatározóvá. Túlzot-tan hosszú inkubációs idő esetén már a gradiens irányú elmozdulásról sem beszélhetünk, sőt a kiegyenlített koncentrációviszonyok között ismét a vizs-gált anyag kemokinetikus hatásai kerülnek előtérbe.

Hátránya még a rendszernek, hogy a sejtek mintegy csapdába esnek az alsó kamrában, visszafelé nem tudnak spontán áthaladni a filteren. Megfelelő előkísérletek elvégzése nélkül, rossz inkubációs időket alkalmazva, lényegé-ben képtelenség elkülöníteni a kemotaxist a kemokinezistől. Mivel a kamrák nem egy sejtet, hanem egy egész sejtpopulációt vizsgálnak fenti probléma komplexitása további elemekkel bővül. Ez indokolja az ilyen kísérletek eseté-ben különösen ajánlott nagyszámú vizsgálat, illetve párhuzamos csoportok elemzésének létjogosultságát.

Gyakorlati útmutató 8 Sokkamrás assay (3D)

Célsejt eukarióta (pl. neutrofil gr.c., monocita) 10⁵-5x10⁶ sejt/ml Anyagigény vizsgálandó anyag, pufferek, filter (∅ 3-5-8 m), 96-lyukú

plate

Egyéb eszköz alternatív lehetőség az áthaladó sejtek fluoreszcens jelzé-sét lehetővé tevő speciálisan előkezelt filter

Kiértékelés /Speciális eszköz alsó kamra – sejtek detektálása MTT, EZ4U stb. mt-dehidrogenáz-assay-k, Alamar blue festés stb.;

filter – fénymikroszkópos számlálás

fluoreszcens jelzés esetén fluoreszcens leolvasó

4.4.1.4 Chemo Tx rendszerek

Mint azt az előzőekben ismertetett assay-nél láthattunk, ugyan nagy haté-konyságú rendszert sikerült kidolgozni, de a kemotaxis kamra egyes elemei-nek többszöri felhasználása miatt, komoly gondok adódhatnak bizonyos ligandok vizsgálatakor (pl. nehezen kimosható lipid-származékok). Ezt a problémát hidalja át a néhány éve kidolgozott Chemo Tx rendszer, aminél az assay elvégzéséhez felhasznált minden elem csupán egyszer kerül felhasz-nálásra.

4.9 ábra Chemo Tx rendszer elemei és működésének vázlatos rajza.

(http://www.neuroprobe.com/products/chemo_tx.html)

Mint az a 4.9 ábrán is jól látható, esetünkben a „kétkamrás” jelleg nagyon leegyszerűsödött: az alsó kamra megmaradt ugyan, de 30 és 300l űrtartal-mú lemezek között választhatunk, a sejteket eredetileg tartalmazó felső kamra a filter gyárilag felhelyezett, vízhatlan, körkörös mintázatává

zsugoro-dik. Ezekre a gyűrűkkel határolt 8 és 25.5 mm²-es felszínekre kerül a sejtes minta egy-egy csepp formájában.

A módszer előnye egyszer használatos volta mellett abban áll, hogy az eltérő méretű alsó kamrák, illetve felső felszínek kombinációival jól alkalmazkod-hatunk mind az egyedi inkubációs időkhöz, mind az esetleg csak kis meny-nyiségben rendelkezésre álló ligandumokhoz. További előnye a módszernek, hogy jól áttekinthető, a korábbi fejlesztésnél gondot jelentő buborékképző-dés könnyen elkerülhető.

Az eljárás hátránya az, hogy különösen a kis volumenek felvitelekor, a rend-szer könnyen kiszárad, melyet a gyártó speciálisan az assay-hez tartozó mű-anyag fedővel ajánl elkerülni, bár hosszabb inkubációk esetén ennek hatása nem mindig kielégítő. További problémát jelenthet a beszerzési ár ma még viszonylag jelentős volta is.

Gyakorlati útmutató 9 Chemo Tx assay (3D)

Célsejt eukarióta (pl. neutrofil gr.c., monocita) 10⁵-5x10⁶ sejt/ml Anyagigény vizsgálandó anyag, pufferek, gyűrűs filter (∅ 3-5-8 m),

96-lyukú plate

Egyéb eszköz alternatív lehetőség az áthaladó sejtek fluoreszcens jelzése pl. Calcein-AM-mel

Kiértékelés / Speciális eszköz alsó kamra – sejtek detektálása MTT, EZ4U stb. mt-dehidrogenáz-assay-k, Alamar blue festés stb.;

filter – fénymikroszkópos számlálás

fluoreszcens jelzés esetén fluoreszcens leolvasó Kivitelezéséhez szükséges idő inkubációs idő kb. 1-4 óra (max. 24 óra)

Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvantitatív

Fő előnye/hátránya számos párhuzamos minta, jó reprodukálhatóság, kis anyagigény

Egyéb lehetőség van igen kis térfogatú minták vizsgálatára is

Ref. 107

4.4.2. Mikrokemotaxis assay

A módszer bevezetése óta legtöbbször hangsúlyozott előnye, hogy nagyon alacsony sejtszám mellett is használható, 10⁵ sejt/lyuk sejtszám elegendő, szemben a Boyden kamrával, ahol 4-8x10⁵ sejt/lyuk sejtszámra van szüksé-günk a megbízhatóan sikeres munkához. Az egyetlen különbség a Boyden kamra és a mikrokemotaxis próba között, hogy ez utóbbi egy plexiből ké-szült 12; 24 vagy 48 lyukú mikrokamrát használ (4.10 ábra), mely lyukainak a térfogata 25 l. Hátránya, hogy technikailag sokkal nehezebben kivitelez-hető, mint a Boyden kamra, valamint az, hogy a kis térfogatok miatt itt is na-gyobb a kamra kiszáradásának veszélye, még nedves-kamra alkalmazása mellett is.

4.10 ábra Mikrokemotaxis kamra összeszerelt és használat előtt szétbontott álla-potban. A kép jól mutatja az egyes kamrákat elválasztó filterek felhelyezésének módját. A látható kamra esetében Az alsó kamrák 25, a felső kamrák 50 l

űrtartal-múak. (http://www.neuroprobe.com/products/ac48.html)

Gyakorlati útmutató 10 Mikrokemotaxis assay (3D)

Célsejt eukarióta (pl. neutrofil gr.c., monocita) 10⁶x10⁷sejt/ml Anyagigény vizsgálandó anyag, pufferek, filter (∅ 3-5-8 m)

Egyéb eszköz alternatív lehetőség az áthaladó sejtek fluoreszcens jelzé-sét lehetővé tevő speciálisan előkezelt filter, szilikon tömítőlemez

fénymikroszkópos számlálás

fluoreszcens jelzés esetén fluoreszcens leolvasó;

CO2-termosztát (5% CO2)

Kivitelezéséhez szükséges idő inkubációs idő kb. 1-4 óra (max. 24 óra) Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvantitatív

Fő előnye/hátránya számos párhuzamos minta, jó reprodukálhatóság, kis anyagigény / kiszáradás veszélye

Egyéb -

Ref.: 52

4.4.3 Transzendoteliális migráció és áramlási assay

A leukociták felhalmozódása és az érfalon való átjutása komplex, több lé-pésből álló (adhézió, rolling, transmigráció) és több tényezőtől függő folya-mat. In vivo a kemokinek mellett számos olyan kemotaktikusan aktív ligand is megtalálható az endotél-felszín érlumen felőli oldalán, amelyek befolyá-solják a leukociták viselkedését. A filteren keresztüli migrációt, valamint a különböző géleket használó assay-k eddig ezeket a környezeti hatásokat nehezen tudták modellezni, leggyakrabban figyelmen kívül hagyták e hatá-sok legtöbbjét. Újabban már sikerült úgy módosítani egyes assay-ket, hogy azok az in vivo állapotot lényegesen jobban megközelítik és az erek falán át történő, mindkét irányú sejtvándorlás jól modellezhető ezekkel. Ilyen módo-sítást jelent, amikor endotél sejtek vékony rétegével vonják be a polikarbonát filterből és nitrocellulóz filterből álló rendszereket (direkt assay) vagy egy polikarbonát filter endotéllel való bevonása után, annak sejtmentes oldalára, egy újabb polikarbonát filterre az extracelluláris mátrix (ECM) egyes

elemei-4.11 ábra A transzendoteliális migráció (TEM) mérésének direkt és reverz módja.

Erre a célra a legtöbbször használt sejttípusok egyike az ún. HUVEC (Human Umblical Vein Endothelial Cells). Ezek az assay-k lehetőséget adnak arra is, hogy kombinált hatásokat vizsgáljunk, így többek között mód van az adhé-zió, vagy az endotél által termelt kemoattraktánsok migrációra kifejtett hatá-sát is megfigyelni, elemezni. Természetesen egy puszta endotél sejtréteg be-iktatásával a használt assay-k még mindig nem megfelelően reprezentálják az in vivo körülményeket, hiszen még számos tényezőt hagynak figyelmen kívül. Ilyen a leukocita adhézióban, illetve az endotélen való áthaladásban fontos szerepet játszó és az erek falában ható erők (ld. nyíróerő) is. Napja-inkban ezt a problémát is sikerül talán csökkenteni, mivel egyes technikák már képesek olyan áramlási rendszereket létrehozni, amellyel az in vivo kö-rülmények elég jól modellezhetők.

Ezekben a „tökéletesnek” látszó rendszerekben is felmerültek azonban bizo-nyos problémák. Talán a legnagyobb gond, hogy egy áramló rendszerben nagyon nehéz kontrollálni a kemoattraktáns anyagok koncentráció-gradiensét, és ez alatt nem csak a szolúbilis anyagokat kell értenünk, hanem az endotél sejtekhez adszorbeálódókat is. Mindezek alapján elmondható,

hogy a ma alkalmazott áramlási assay-k ugyan új utat nyitottak az in vivo állapot mind jobb megközelítése érdekében, de ma még csupán a felszínhez kötött, haptotaktikus ligandok vizsgálatában nyújthatnak megbízható segít-séget.

Gyakorlati útmutató 11 Transzendoteliális migráció (3D)

Célsejt eukarióta (pl. neutrofil gr.c., monocita) 10⁵-10⁶ sejt/ml Anyagigény vizsgálandó anyag, pufferek, filter (∅ 3-5-8 m), valamint

a filter bevonására alkalmas endotél sejttenyészet

Egyéb eszköz a vizsgálatokat leggyakrabban a célra egyedileg kialakított kamrákban végzik, melyekben az attraktáns mint mozgó fázis alkalmazható

Kiértékelés /Speciális eszköz a kitapadó és migráló sejtek számának meghatározása az endotéllel bevont filter festésével és mikroszkópos kiérté-kelésével történik;

CO2-termosztát (5% CO2)

Kivitelezéséhez szükséges idő inkubációs idő kb. 1-24 óra (célsejt-függő, leggyakoribb 3-4 óra)

Kvalitatív / kvalitatív jelleg kvantitatív

Fő előnye/hátránya a fiziológiás állapotot jól modellező rendszer /

a klasszikus kemotaxis és a haptotaktikus hatás nehezen elkülöníthető

Egyéb -

53

In document A kemotaxis mérése egysejtűekben és magasabb rendű szervezetekben - Módszertani útmutató (Pldal 94-109)