Ligandumfüggő interdomén mozgások

Az interdomén mozgások vizsgálatához mindegyik sokaság PDZ1 doménjént egy közös templátra illesztettem, amelyek, tekintettel a domén stabil, globuláris szerkezetére, nagyon jól illeszkednek egymáshoz (Cα RMSD = 0,81 Å). Ugyanakkor a PDZ2 domének ezáltal a térben nagyon szétszórtan helyezkednek el (Cα RMSD = 22,93 Å) (16. ábra).

16 ábra: Mindhárom generált PDZ1-2 tandem sokaság, egy közös PDZ1 templátra illesztve. Az rajzolószoftver számítási kapacitásának végessége miatt az ábrán csak minden tizedik replika szerepel.

56

Mivel az interdomén mozgások amplitúdója jóval nagyobb, mint az intradomén mozgásoké, ez az elrendezés kifejezetten alkalmas a két domén reorientációjának vizsgálatára. Ehhez egy olyan főkomponens-analízist végeztem el a PDZ2 domén rövidített szakaszán (99-183 aminosav), amely során a teljes sokaság közös PDZ1 templátra való illesztése után nem mozdítottam el a szerkezeteket.

(Alapesetben a főkomponens-elemzés első lépése a szerkezetek egymáshoz történő illesztése – most azonban ezt a lépést elhagytam.) Az ilyen módon meghatározott főkomponensek tehát a PDZ2 domén elmozdulását reprezentálják a PDZ1 doménhez képest. A továbbiakban a teljes sokaságnak az így elvégzett főkomponens-elemzésből kapott első két főkomponens mentén történő ábrázolását interdomén PCA-ábrának fogom hívni (17.A ábra).

Szembetűnő, hogy az interdomén PCA-ábrán a pontok nagyjából egy kör mentén helyezkednek el (17.A ábra). Megállapítottam, hogy a körív mentén történő elmozdulás a háromdimenziós térben a PDZ2 domén körkörös elmozdulásának felel meg a PDZ1 domén körül, míg a sugárirányban történő elmozdulás a két domén egymáshoz való közeledését-távolodását reprezentálja. Ennek számszerűsítésére a következő eljárást végeztem el. Meghatároztam a PCA-ábra pontjaira legjobban illeszkedő kör sugarát, és az ábrára két kört rajzoltam ugyanazzal a középponttal, ám az eredeti sugár 0,8-, illetve 1,1-szeresével. Ezt a két kört 16 ekvidisztáns pontban mintavételeztem, és megkerestem a mintavételezési pontokhoz legközelebb eső pontot a PCA-ábrán (17.B ábra). Végül kiszámoltam az ezeknek a pontoknak megfelelő PDZ2 domének Cɑ atomjainak tömegközéppontját, és ezekre a pontokra is illesztettem egy-egy kört a háromdimenziós térben (17.C,D ábra). Így gyakorlatilag bebizonyítottam, hogy az interdomén PCA-ábrán mutatkozó kör megfeleltethető egy körnek a háromdimenziós térben.

A PDZ2 domén körkörös mozgása lehetővé teszi az interdomén torziós szög értékének számszerű definícióját. Ehhez a kétdimenziós PCA-ábrára legjobban illeszkedő körből indultam ki. Ezt szintén 16 ponton mintavételeztem, és a mintavételi pontokhoz legközelebb eső adatpontoknak megfelelő szerkezetből ismét kiszámoltam a PDZ2 domén tömegközéppontját – az imént bemutatott módszerrel –, majd pedig ezekre a pontokra is meghatároztam a legjobban illeszkedő kört a háromdimenziós térben.

E kör középpontját és normálvektorát kiszámoltam a PDZ1 domén atomjaihoz képest: egészen pontosan a Phe17, Ile57 és Val84 Cɑ atomjai által meghatározott koordináta-rendszerben. Azért ezt a három atomot választottam, mert a másodlagos szerkezetnek robosztus építőelemei (a β2, β3 és β6 szál részei), és alacsony a lokális RMSD-jük. Ezáltal lehetővé válik, hogy bármely tetszőleges PDZ1 szerkezethez hozzárendeljünk egy háromdimenziós kört, amely mentén a PDZ2 elmozdulását várjuk. Az interdomén torziós szög végül a PDZ2 tömegközéppontjának és a PDZ1 domén Phe17 aminosav Cɑ atomjának a körre való projekciójából, vagyis e két pontnak a kör középpontjával bezárt szögeként adódik (18.A ábra).

57

17. ábra: A: A PDZ1 domének közös templátra való illesztését követő, PDZ2 domének rövidített szakaszán (99-183 aminosav) elvégzett főkomponens-elemzés ábrázolása az első két főkomponens mentén. B: A pontokra legjobban illeszkedő kör sugarának 0,8, illetve 1,1-szeres nagyítása 16 ekvidisztáns pontban mintavételezve, a mintavételezési pontokhoz legközelebb eső PCA-pontok kiemelésével. C, D: A kiemelt PCA-pontoknak megfelelő PDZ szerkezetek Cɑ atomjainak tömegközéppontja térben ábrázolva, és az azokra illesztett háromdimenziós kör.

Az imént bemutatott módszerrel meghatározott interdomén torziós szög nagyszerűen korrelál a kétdimenziós PCA-ábra pontjaiból meghatározott polárkoordináták szögkomponensével (R = 0,98), ami szemléletesen bizonyítja kétdimenziós ábrán és a háromdimenziós térben megfigyelhető körök egymásnak való megfelelését.

Az interdomén torziós szögre az eredeti tanulmány szerzői, Wang és mtsai. is adtak egy definíciót (W. Wang et al., 2009). Az ő megközelítésükben ezt a szöget a két doménhez kötődő ligandum 3 C-terminális aminosavjának tömegközéppontja és a két PDZ domén tömegközéppontja határozza meg:

egészen pontosan a tkplig1-tkpPDZ1-tkpPDZ2-tkplig2 pontok által definiált torziós szögként adódik, ahol tkplig

az ligandum atomjainak, tkpPDZ pedig a PDZ domén atomjainak a tömegközéppontja. Megállapítottam, hogy az általam definiált torziós szög (ɑ), és a Wang és mtsai. általi definícióból reprodukált torziós

58

szög (ɸ) egy fáziskorrekciót követően szintén nagyon jól korrelálnak egymással (R = 0,85, p < 0,0001) (18.B ábra).

Szembetűnő, hogy a ligandum jelenléte milyen nagy mértékben befolyásolja az interdomén mozgásokat: a PCA-ábra tanúsága szerint a komplex sokaság által lefedett konformációs tér jóval nagyobb, mint a szabad sokaság által lefedett (17.A ábra). Ugyanezt a következtetést lehet levonni az interdomén torziós szögekből: a komplex szerkezetek interdomén torziós szöge jóval nagyobb tartományban változik, mint a szabad szerkezeteké (18.B ábra). Ennek a felismerésnek igen nagy jelentősége van. Azt bizonyítja ugyanis, hogy sikerült olyan szerkezeti sokaságokat létrehoznom, amelyek egyfelől megfelelnek a kísérletes paramétereknek (5. táblázat), másfelől viszont tükrözik Wang és mtsainak fő konklúzióját, azaz hogy a ligandumkötés jelentős interdomén mozgásokat indukál.

18. ábra: interdomén szögek ábrázolás a PDZ1-2 tandemben. A: az interdomén szög meghatározása szemléletesen ábrázolva (ld. YYY fejezet). B: az itt bemutatott (α), valamint a Wang és mtsai. által publikált (Φ) módszerrel számolt interdomén szögek korrelációja az általunk előállított sokaságra meghatározva.

Ahogy azt az intradomén mozgások esetén is megállapítottuk, az S²-megkötéseknek nincs szembetűnő hatása az interdomén dinamikára. Az PCA-ábrán nincs olyan régió, amelyet kizárólag a megkötött sokaság fedne le (F7. ábra). Ellenkezőleg: a nem megkötött komplex sokaság mutat némi eltérést a szabad és a megkötött komplex sokaság által bejárt interdomén konformációs tértől. Ez felvethetné a kétséget a nem megkötött komplex sokaság hitelessége felől, ám ne felejtsük el, hogy a szabad szerkezetre nem álltak rendelkezésre kísérletes rendparaméterek, amelyeket kényszerfeltétleként alkalmazhattam volna, így félrevezető kizárólag valamely sokaság által lefedett vagy nem lefedett régió nagyságáról messzemenő következtetéseket levonni.

59