A leghangsúlyosabb belső mozgások

Annak érdekében, hogy össze tudjam hasonlítani a három vizsgált fehérje belső mozgásait, egymáshoz illesztettem őket a többszörös szerkezetillesztés (multiple structure alignment) módszerrel, a MAMMOTH-MULT programcsomagot használva. A konszenzus szekvencia 89 aminosavat tartalmaz, és magába foglalja a kötőzsebet és az azt körülvevő lebenyek túlnyomó részét (25. ábra).

Elsőként elvégeztem egy-egy főkomponens-elemzést a három fehérjéhez tartozó eredeti, megkötött és nem megkötött sokaság összevonásával létrehozott sokaságon (26. ábra). Az adatpontok első két főkomponens mentén történő eloszlásából megerősíthetjük a globális RMSD-kből levont következtetést: a megkötött sokaságok szűkebb konformációs teret fednek le, mint a nem megkötött sokaságok. A főkomponens-ábrákon az is látszik, hogy (CsPinA esetét kivéve) a nem megkötött sokaságok által lefedett konformációs tér tartalmazza a megkötött sokaságokat, amelyek pedig tartalmazzák az eredeti sokaságokat. Ez a tendencia még feltűnőbb a csak a konszenzus szekvencia aminosavjaira elvégzett főkomponens-elemzés eredményét mutató ábrázolásokon.

A három különböző parvulin belső mozgásainak összehasonlításához a megkötött sokaságok konszenzus szekvenciájához tartozó aminosavjain egy újabb főkomponens-elemzést végeztem el (27.

ábra). A három fehérje jól szeparálódik az első két főkomponens mentén, melyek a megkötött sokaságok esetén a teljes variancia 44 és 25%-át, a nem megkötött sokaságok esetén pedig 36 és 24%-át teszik ki.

A megkötött és nem megkötött sokaságokból számolt főkomponensek egymással alacsony átfedést mutatnak, leszámítva a megkötött sokaság első és a nem megkötött sokaság második főkomponensét (28.A ábra). Ez a főkomponens a kis és a nagy lebeny egymástól való eltávolodását és közeledését, egyfajta légző mozgást reprezentál, amely valójában éppen a kötőzseb kinyílásának és becsukódásának felel meg (28.B ábra). A kötőzseb nyitottságát intuitívan a két lebeny tetején lévő két aminosav Cα atomjának távolságával lehet számszerűsíteni, amely a megkötött sokaságok esetén figyelemreméltóan jól korrelál az első főkomponenssel (R = 0,82, p < 0,0001). Világosan látszik, hogy a három fehérje más-más régiót fed le nemcsak az első főkomponens, hanem a kötőzseb nyitottságának megfelelő dimenzióban is: az SaPrsA a leginkább zárt, a CsPinA valamivel nyitottabb, és a TbPin1, amelyik a legszélesebb tartományt öleli át az ábrán, egyúttal a legnyitottabb (28.C ábra). A légző

77

mozgás tehát a TbPin1 fehérjében a legdominánsabb, és valamivel kisebb mértékben ugyan, de jelen van a másik két fehérjében is.

26. ábra: A három vizsgált fehérjéből készült sokaságok egymásra illesztve (felső sor), illetve a megkötött, nem megkötött és az eredeti sokaságokat tartalmazó összevont sokaságokon elvégzett főkomponens-elemzés ábrázolása. Külön ábrák mutatják a teljes fehérjéken (középső sor), illetve csak a konszenzus szekvenciákon elvégzett (alsó sor) főkomponens-elemzés eredményeit.

Az általános rendparaméterek a fehérje gyors (ps-ns) mozgásait reprezentálják. A létrehozott sokaságoktól elvárható, hogy egy, a natív állapothoz közeli, átlagos szerkezet körüli gyors fluktuációt tükrözzenek, amelyről a főkomponens-elemzés ad szemléletes képet. Azonban TbPin1 által széles tartományban mintavételezett légző mozgásától azt várnánk, hogy ennél valamivel lassabb időskálán történik.

Ezt a látszólagos ellentmondást az a feltevés oldja fel, amely szerint az S²-kényszerfeltételek elsősorban nem a mozgások amplitúdójára, hanem azok irányára jelentenek megkötést. Az RMSD-értékek is azt mutatják, hogy a TbPin1 semmivel sem flexibilisebb a másik két fehérjénél (6. táblázat).

A főkomponens-elemzés eredményeit is figyelembe véve azt mondhatjuk, hogy a TbPin1-ben a

78

konformációs fluktuáció a másik két fehérjéhez képest hasonló mértékű, de más irányban történik, ami más főkomponenseket eredményez.

27. ábra: A három különböző parvulin fehérjét tartalmazó egyesített sokaságok, és az azokra elvégzet főkomponens-analízis eredménye. Az elemzéshez csak a konszenzus szekvencia aminosavjait használtuk fel (ld.

25. ábra). A főkomponens-elemzést elvégeztük csak a megkötött, csak a nem megkötött, valamint a megkötött és nem megkötött sokaságokból álló kombinált sokaságra.

28. ábra: A megkötött parvulin-sokaságokra meghatározott első főkomponens és a kötőzseb nyitottsága közötti összefüggés. A: A megkötött és nem megkötött sokaságok első öt főkomponense közötti átfedés, külön feltüntetve az egyik kiugró értéket. B: Az első főkomponens által reprezentált leghangsúlyosabb mozgás. A két szerkezet a két extrém konformációnak felel meg. Piros színnel van jelölve az a két aminosav, amelyeket a kötőzseb nyitottságának definíciójához felhasználtam. C: A három sokaság eloszlása a kötőzseb nyitottsága és az első főkomponens szerint, feltüntetve a korrelációt is.

Ne felejtsük el, hogy a légző mozgást reprezentáló, első főkomponens valójában a három megkötött sokaságot tartalmazó, kombinált sokaság első főkomponenseként adódott, így nem elvárható, hogy mindegyik fehérjében ez a bizonyos légző mozgás, még ha jelen is van, a leghangsúlyosabb mozgások között legyen. Ezt igazolják az egyes megkötött sokaságok főkomponensei és a kombinált

79

sokaság főkomponensei közötti átfedések (28. B ábra). A CsPinA-ban és a SaPrsA-ban a légző mozgás nem jelenik meg észrevehetően az első négy főkomponens között. A TbPin1-ben is csak az első főkomponenssel mutat némi átfedést, de ebbe a főkomponensbe más mozgások is belekeverednek.

A létrehozott sokaságok valójában nem bizonyítják, hogy a légző mozgás ténylegesen, a szimulációban is mintavételezett gyors időskálán történik. Egy plauzibilis értelmezés, hogy a sokaságok a gyors mozgások által lefedett konformációs tér maximumát mintavételezik, de a lassú mozgások szerinti más-más állapot körül. Mindenesetre a kísérletes S²-eknek való jó megfelelés mindenképp megerősíti azt a feltevést, hogy ezekben a fehérjékben jelen van a légző mozgás. A TbPin1 ráadásul foszforilált ligandumok izomerizációját katalizálja, ezért a kötőzseb viszonylag nagy amplitúdójú kinyíló-becsukódó mozgásának ténylegesen lehet szerkezeti biológiai relevanciája. Ezt erősíti az a megfigyelés, hogy a TbPin1 foszfátkötő hurokrégiójában néhány aminosavnál NMR-es relaxációs kísérletekkel kémiai kicserélődést figyeltek meg, igaz, a lassabb időskálán (Sun et al., 2012).