Latenciaidő-mérésen alapuló állatkísérletes magatartási tesztek

Ezeknél a módszereknél küszöbfeletti intenzitású hőingert irányítanak az állat adott testrészére (típusosan farok, végtagok), és az elkerülő, nocifenzív reakció bekövetkeztéig eltelt latenciaidőt mérik (1. ábra). Lézeres hőstimulátor – amely kevesebb mint 250 ms alatt növeli a hőmérsékletet a beállított értékre – alkalmazásával kimutatták, hogy minél magasabb az ingerlési hőmérséklet a 40–51 °C-os tartományban, annál rövidebb a fájdalomérzet kialakulásának latenciaideje (Campbell és LaMotte, 1983).

Standard módszer a „tail-flick” teszt, amelynek során sugárzó hőt irányítanak a kézben tartott vagy más módon mozgásában akadályozott állat (patkány, egér) farkára, és a farok elrántásáig eltelt időt mérik (D’Amour és Smith, 1941; Smith et al., 1943). Fontos, hogy a

sugárzó hő hatására viszonylag lassan, az idő négyzetgyökével arányosan nő a besugárzott bőr hőmérséklete (2. ábra, A panel; Buettner, 1951). Emiatt van idő arra, hogy először a C típusú melegreceptorok aktiválódjanak átmeneti jelleggel, majd ezzel átfedésben a C polimodális nociceptorok, ez utóbbiakkal átfedésben az Aδ polimodális nociceptorok, végül a polimodális nociceptorok mellett paradox módon az – amúgy nem fájdalmas hidegre érzékeny – Aδ hidegreceptorok és az Aδ magas küszöbű mechanonociceptorok (2. ábra, D panel). A „tail-flick” reakció spinális reflex eredménye (Irwin et al., 1951; Bonnycastle et al., 1953; Sinclair et al., 1988). A latenciaidő függ a farok bőrének – dominánsan a farok perfúziója és az aktuális környezeti hőmérséklet által meghatározott – kiindulási hőmérsékletétől: alacsonyabb bőrhőmérséklet hosszabb latenciaidőt eredményez és fordítva (Berge et al., 1988;

2. ábra (Le Bars et al., 2001). A bőrhőmérséklet alakulása az idő függvényében sugárzó hővel (A panel), kontakt hővel (B panel), illetve forró vízbe merítéssel (C panel) történő hőstimuláció esetén. A D panel a különböző rostfajták bőrhőmérséklet–aktivitás összefüggését mutatja.

10

Eide és Tjolsen, 1988). Hangsúlyozandó, hogy a farok fontos szerepet játszik a patkány és egér hőszabályozásában, emiatt a farokbőr hőmérséklete jelentősen ingadozhat, még termoneutrális környezetben is jelentős fluktuáció detektálható (El Bitar et al., 2014). Egyes analgetikumok, pl.

a morfin vazokonstrikciót okoz a farokban, ami a latenciaidő megnyúlását eredményezi, zavart okozva a szer termális antinociceptív hatásának megítélésében (El Bitar et al., 2016). Emberben is kimutatták, hogy a bőrhőmérséklet emelkedése lecsökkenti a sugárzó hővel kiváltott fájdalomérzet latenciaidejét, ellenben a termális fájdalomküszöb változatlan marad (Pertovaara et al., 1996). Az aktuális környezeti hőmérséklet jelentős latenciaidő-befolyásoló hatását újabb, korszerű metodikát alkalmazó vizsgálatok is megerősítették mind patkányban, mind egérben (Benoist et al., 2008; Pincedé et al., 2012). Kimutatták azt is, hogy a latenciaidő függ a bőrterület pigmentációjától, a sugárzás intenzitásától, a stimulált bőrfelület nagyságától, valamint a stimuláció farkon belüli pozíciójától (Winder et al., 1946; Caroll, 1959; Kawakita és Funakoshi, 1987; Ness et al., 1987). A „tail-flick” teszt további hátránya, hogy ismételt kiváltása esetén habituációt (latenciaidő-megnyúlást) mutat, amelynek mértéke nagyobb, ha erősebb ingert és kisebb időközzel ismételnek (Groves és Thompson, 1970; Carstens és Wilson, 1993).

Analgetikus hatású szerek vizsgálata során szükséges egy ún. „cut-off” (maximális besugárzási) idő beállítása a szöveti károsodás elkerülése érdekében. A „tail-flick” módszerrel az erős ópioid agonisták hatását megbízhatóan lehet mérni, a gyenge agonisták és a nem-szteroid gyulladásgátló analgetikumok (NSAID-ok) vizsgálata problematikus (a részleteket illetően lásd Le Bars et al., 2001).

A „tail-flick” teszt egyik variánsa, amikor a kézben tartott egér vagy patkány farkát konstans hőmérsékletű forró vízbe mártják, és a farok kirántásáig eltelt latenciaidőt mérik („tail immersion” vagy farokbemerítéses teszt, Ben-Bassat et al., 1959). Ebben az esetben nagy felületet ér a hőinger, és gyorsan emelkedik a bőr hőmérséklete, emiatt a választ az Aδ polimodális nociceptorok és – paradox módon – az Aδ hidegreceptorok, illetve Aδ magas küszöbű mechanonociceptorok aktivációja dominálja (2. ábra, C és D panel). Lehetőség van különböző hőmérsékletű (típusosan 48–56 °C) vízfürdők alkalmazására, amelyek értelemszerűen eltérő latenciaidőket eredményeznek: alacsonyabb hőmérsékletnél hosszabb a latenciaidő és fordítva. Alacsonyabb vízhőmérséklet alkalmazása növeli az érzékenységet a kisebb hatékonyságú analgetikumok (gyenge ópioid agonisták, NSAD-ok) iránt (Sewell és Spencer, 1976; Luttinger, 1985). Egy másik variáns esetében az egyik hátsó végtagot merítik állandó hőmérsékletű forró vízbe („paw immersion” vagy lábbemerítéses teszt).

A Hargreaves-féle „paw withdrawal” vagy „plantar” teszt (plantárteszt) elvében hasonló a „tail-flick” teszthez, de ebben az esetben az átlátszó plexilapon szabadon mozgó

patkány vagy egér talpára irányítanak hősugárzást, és a láb elemeléséig eltelt időt mérik (Hargreaves et al., 1988). Előnye, hogy a termoregulációban fontos szerepet játszó farok helyett a hátsó végtag reakcióját méri. Mindazonáltal patkányban kimutatták, hogy a kiindulási bőrhőmérséklet – ami függ az aktuális környezeti hőmérséklettől – ennél a tesztnél is befolyásolja a latenciaidőt, és még termoneutrális környezetben is jelentős periodikus fluktuáció mutatható ki a hátsó végtag bőrének hőmérsékletében (El Bitar et al., 2014; Vítková et al., 2015). A környezeti hőmérséklet csekély, 2–4 °C-os változása már szignifikáns eltérést eredményez a latenciaidőben (nemcsak a hátsó végtagon, hanem a mellső végtagon és a farkon is). A módszer további hátránya, hogy az állat talpa nem mindig egyforma mértékben simul hozzá az aljzathoz.

A „hot plate” (forró lap) teszt (Woolfe és Mac-Donald, 1944) esetében az egér vagy patkány szabadon mozog egy fémfelületen, amelynek hőmérsékletét állandó értéken (48–56 °C) tarják; gyakran használt hőmérséklet az 52 vagy 55 °C. A típusos nocifenzív reakció valamelyik végtag nyalása, illetve az állat ugrása, de egyéb magatartásformák is előfordulhatnak. Ezek a reakciók szupraspinálisan integrálódó magatartásformák. A teszt esetében valószínűsíthető, hogy a bőrhőmérséklet ugyanúgy lineárisan változik az idővel, mint a termód (lásd 1.3.4. pont) esetében. A teszt ismétlésekor tanulási folyamat figyelhető meg, ami a latenciaidő rövidüléséhez vezet (Knoll et al., 1955). A módszer esetében jelentős a kiindulási (kontroll) latenciaidő állatcsoportok közötti variabilitása, ami abban nyilvánul meg, hogy ugyanazon laboratóriumban különböző vizsgálatok keretében végzett mérések eltérő latenciaidőket mutatnak (Vierck és Cooper, 1984). A forró lap módszerrel elsősorban a nagy hatékonyságú ópioid agonisták hatását lehet megbízhatóan mérni, a gyenge agonisták és az NSAID szerek vizsgálata nehézkes (Le Bars et al., 2001). Ez utóbbiaknál 50 °C-nál alacsonyabb laphőmérséklet alkalmazása elősegítheti az antinociceptív hatás kimutatását (Ankier, 1974).

Általánosan elfogadott, hogy az állatkísérletekben típusosan használt, latenciaidőmérésen alapuló termonociceptív tesztek esetében alaphelyzetben a nocifenzív reakciót A nociceptorok által szállított impulzusok váltják ki. Más azonban a helyzet gyulladásos hiperalgézia esetében, mivel a képződő mediátorok hatására a C polimodális nociceptorok nagyobb mértékben képesek szenzibilizálódni a hőingerekkel szemben, mint az A nociceptorok (ennek részeként hőküszöbük lecsökken), és a számuk is nagyobb, mint az A rostoké. Ezen túlmenően az alvó („silent”) C nociceptorok (C-MiHi) is aktiválódnak gyulladásos környezetben. Mindez azt jelenti, hogy gyulladás esetén a jelentős mértékben szenzibilizálódott C rostok alacsony hőküszöbük miatt a kisebb vezetési sebességük ellenére hamarabb bejuttatják az információt a központi idegrendszerbe, és ezáltal aktivációjuk felelős a nocifenzív reakció kiváltásáért.

12