Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.6. Flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek (FDO)

2.6.2. Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek

A réztartalmú FDO enzim mellett az első vastartalmú kvercetináz enzimet 2003-ban izolálták. Az enzimológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az enzim aktív centruma nagy hasonlóságot mutat a korábban vizsgált réztartalmú enziméhez. A vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy az enzim katalizálja a flavonolok oxigénezési reakcióit, tehát flavonol 2,4-dioxigenáz aktivitást mutat. A spektroszkópiai vizsgálatok (ESR) alapján az aktív centrumban vas(II)- és vas(III)ion jelenléte is kimutatható volt [62]. Az inhibíciós vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy a kvercetin átalakulásáért a vas(II)ion felelős. A kísérletek során a Fe(II) specifikus inhibitorok – 1,10-fenantrolin és 2,2‘-bipiridin – 50 százalékos inhibíciót okoztak mindössze 200 μM koncentrációban. Érdemes megjegyezni, hogy a Fe(III) specifikus inhibítor (Tiron) a kísérletek során növekedést eredményezett az aktivitásban, alátámasztva a vas(II) szerepét [63].

A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezetét a 9. ábra szemlélteti. A vas-tartalmú FDO enzimek a rézvas-tartalmúakhoz hasonlóan két, egyenként egy vasat tartalmazó alegységből álló homodimer. Mindkét alegységben – melyek között csekély geometriai eltérés figyelhető meg – a Fe(II)-ion pentakoordinált formában helyezkedik el. A szerkezetek között megfigyelhető eltérések a fémet megkötő glutamát nyílt és zárt geometriai formái közti különbségnek tulajdoníthatók (10. ábra) [64].

9. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezete [64]

Shaab és munkatársai Escherichia coli baktérium segítségével különböző kétvegyértékű fémet tartalmazó kvercetináz enzimeket állítottak elő. Mn(II), Co(II) és Cu(II) hozzáadása esetén aktív enzim keletkezett, míg Zn(II), Fe(II) és Cd(II) alkalmazása során nem

volt szignifikáns aktivitás-növekedés. Az ily módon előállított Mn(II)- és Co(II)-tartalmú kvercetinázokat tisztították és jellemezték. Az ESR spektrumok alapján megállapították, hogy a Mn(II)-tartalmú enzimben a két mangánion oktaéderes koordinációjú. A kinetikai vizsgálatok során kimutatták, hogy a mangántartalmú enzim mintegy negyvenszer nagyobb aktivitást mutat, mint a Fe(II)-tartalmú kvercetináz és közel azonos aktivitású, mint a Cu(II)-tartalmú (4. táblázat), az eredmények alapján tehát a kvercetináz enzim aktív centruma feltételezhetően Mn(II)-tartalmú [65].

10. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezete [64]

4. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [63]

Fém^a Atomok/alegység kkat (s^-1) KM (µM) KM(O2)( µM)

Mn 1,8 25±1 4,0±0,9 90±10

Co 0,65 6,7±0,2 7,5±0,5 79±5

Fe 0,80^b 0,65±0,02 5,2±0,6 150±9

2008-ban Merkens és csoportja egy új organizmusból, a Streptomyces baktériumból különítettek el FDO enzimet Escherichia coli baktérium segítségével. A baktériumból kinyert természetes enzimhez különböző átmenteti fémeket adva vizsgálták az aktivitásokat, hasonlóan, mint a B. subtilis esetében. A Ni(II)és Co(II)fémiont tartalmazó enzim a kinetikai mérések során nagy aktivitást mutatott a Mn(II), Fe(II), Cu(II), Zn(II) központi fémiont tartalmazó enzimekhez képest (5. táblázat) [66].

5. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [67]

Fém^a Atomok/alegység k_kat (s^-1) K_M (µM) K_M(O₂)( µM)

Fe 0,44^b 1,5±0,1^b 14,1±0,7^b -

Co 0,33 7,6±0,5 0,96±0,05 1230±310

Ni 0,55 40,1±3,4 5,75±0,12 256±45

Berreau és munkatársai vas-, mangán-, kobalt- nikkel- réz- és cinkartalmú flavonolát komplexeket állítottak elő, és vizsgálták, hogyan befolyásolja a központi fémion tulajdonsága a szerkezeti, spektroszkópiai és redoxi tulajdonságokat, valamint tanulmányozták a ligandumkicserélődési reakcióikat. A komplexek dioxigénnel való reakcióját csak a vas(II)komplex esetében végezték el, amelynek során az enzimatikus úttól eltérően egy µ-O-vas(III)komplex keletkezett [68].

Funkcionálisan működő vas-, mangán-, és nikkeltartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimmodell-rendszerek az irodalomban eddig még nem ismertek, tehát ezen modellreakciókról szerzett tapasztalataink segíthetnek tisztázni a fém(ek) enzimben betöltött szerepét.

2.7. -Ketoglutarát-függő oxidáz és oxigenáz enzimek ( KGDO)

Az oxidoreduktáz enzimek fontos csoportját képezik az -ketoglutarát-függő oxidázok és oxigenázok [69], amelyek különböző, biológiailag fontos vegyületek, pl. aminosav-oldalláncok hidroxilezési reakcióinak katalízisét végzik. Az -ketosav ebben az esetben kofaktorként, vagyis az enzim működését elősegítő csoportként funkcionál.

Általánosságban elmondható róluk, hogy -ketosav jelenléte nélkül az enzimatikus reakció (kevés kivétellel) nem játszódik le. Másik fontos sajátságuk, hogy bár

aminosav-18

szekvenciájuk jelentős változatosságot mutat, az aktív helyük szinte kivétel nélkül két hisztidines nitrogénnel és egy glutaminsavból, vagy aszparaginsavból származó karboxilát-funkcióval kötött vas(II)iont tartalmaz. A 2N,O donoratom-csoport mellett még három vízmolekula kapcsolódik a vas(II)centrumhoz (11. ábra) [70], így alakul ki a hatos

11. ábra A vastartalmú KG-függő dioxigenázok reakcióira javasolt általános mechanizmus

A 11. ábrán látható javasolt mechanizmus [71] épp ezért szinte az összes KGDO enzimre érvényes. Első lépésben az -ketosav kétfogú ligandumként való koordinációja történik öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezzel párhuzamosan két vízmolekula kiszorul a koordinációs övezetből. A szubsztrátum ezután megkötődik a vas(II)ion közelében, kiszorítva a maradék vízmolekulát a vas(II)ion mellől, utat nyitva egy dioxigén molekula koordinációjának. A vas(III)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes a ketosav ketonos szénatomját támadni, peroxo-vas(IV) intermedier kialakulását eredményezve. Az O O kötés felhasadásával végül létrejön az oxovas(IV) egység, amely a közelben rögzített szubsztrátum C H kötését támadja. A termékek (hidroxilezett szubsztrátum, szén-dioxid és karbonsav) a ciklus zárásaként elhagyják az aktív helyet. Az előbbi átmeneti állapotok közül többnek a röntgenszerkezete is ismert.

A fenti mechanizmussal írható le többek között az alábbi enzimek működése, a nukleinsavak metabolizmusát katalizáló timin hidroxiláz (TH) (9) [72]; a taurin dioxigenáz (tauD) (10), amelynek a szulfit metabolizmusban van szerepe [73]; a prolil 4-hidroxiláz (P4H) (11), amely a kollagént stabilizáló 4-hidroxi-prolint állítja elő [74]; a 4-hidroxi-fenil-piruvát dioxigenáz (4HPPD) (12), ahol maga a kofaktor a szubsztrátum is egyben [75]. A fenti kiragadott példákból látható, hogy ezen enzimek igen fontos szerepet játszanak az élő

szervezetek anyagcsere folyamatainak szabályozásában. Nem csoda, hogy számos réz- és vastartalmú modell született működésük jobb megértésére, illetve hasonló, gyakorlati szempontból fontos reakciók katalizálására [76-80].

2.7.1. 1-Amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz (ACCO) enzim és modellreakciói

Az etilén növényi hormon, a gyümölcsök érését gyorsítja, és a növények virágzására hat, a magvak csírázását és a hagymák, gumók kihajtását befolyásolja. Az etilént a kertészetben és a gyümölcstermesztésben is felhasználják hormonhatása miatt, mivel a zölden szedett gyümölcsöknek (például a banánnak) segíti az utóérését, és időzíthető vele egyes dísznövények virágzása (bizonyos határok között). A növényekben az etilén bioszintézisének utolsó lépése az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav (accH) átalakítása, melyet az ACC oxidáz enzim katalizál (13) [81-84].

CO₂

-NH₃⁺ ACCO + HCN + CO₂+ 2H₂O

2 H⁺+ 2 e^- (13)

A Petunia hybrida-ból izolált enzim (ACCO) szerkezetét a 12. ábra szemlélteti.

Röntgendiffrakciós mérések alapján megállapították, hogy a központi fémionhoz 2 hisztidin

(His177, His234) és egy aszparaginsav (Asp179), (2N, O) koordinálódik egyfogú ligandumként [85].

12. ábra ACC oxidáz enzim szerkezete [85]

Az ACC oxidáz enzim eltérően a többi KGDO proteintől, működéséhez nem 2-oxoglutarát, hanem aszkorbát koszubsztrát szükséges, emellett a szén-dioxid (vagy bikarbonát), mint aktivátor játszik szerepet az etilén szintézise során. Mágneses cirkuláris dikroizmus (MCD) vizsgálatokkal alátámasztották, hogy az enzim aktív centrumában jelenlévő vas(II)ion alapállapotban hatos koordinációjú, hasonlóan a többi, ebbe a csoportba tartozó enzimhez. A szubsztrátum koordinációját tekintve szintén eltérés tapasztalható a többi KGDO enzimtől. Míg utóbbi esetben az α-ketosav jobban kötődik a központi fémionhoz, mint az átalakítandó szubsztrátum, addig az ACCO enzim esetében az szubsztrátum (accH) mind az amino-, mind pedig a karboxilát-csoportján keresztül közvetlenül koordinálódik a központi vas(II)ionhoz. A szubsztrátum és a koszubsztrát hozzáadását követően az aktív helyen ötös koordináció alakul ki, amely elősegíti a dioxigén megkötődését és aktiválását.

Ezen eredmények összhangban vannak a korábban elvégzett ún. „steady-state” kinetikai mérésekkel, ahol bebizonyították, hogy a szubsztrátum a dioxigén előtt koordinálódik a központi fémionhoz. Az azonban még nem tisztázott, hogy a koszubsztrát az accH előtt vagy a dioxigén után kordinálódik a vas(II)ionhoz [82, 86-94].

2006-ban Klinman és munkatársai 3 nyíltláncú, valamint 4 gyűrűs aminosavval végeztek mechanizmus vizsgálatokat. Megállapították, hogy a gyűrűs származékok esetében etilén keletkezett, az alifás aminosavak esetében pedig dekarboxileződés játszódott le. A kinetikai vizsgálatok eredményeit a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az adatokból jól látható,

hogy nincs egyértelmű összefüggés a szubsztrátumok szerkezete, kötésfelhasadási energiái és a reakció sebessége között (kkat). Ebből arra lehet következtetni, hogy a sebességmeghatározó lépés a szubsztrátum aktiválását megelőzően történik, melynek során egy oxovas(IV) részecske alakul ki. A reakciók feltételezett mechanizmusát a 13. ábra szemlélteti [95].

6. táblázat ACC oxidáz enzim kinetikai vizsgálatának eredményei (BDE: kötésfelhasadási energia)

13. ábra ACCO enzim feltételezett működési mechanizmusa (Asc: aszkorbát; DHAsc: dehidro-aszkorbát)

Első lépésként a szubsztrátum kétfogú ligandumként való koordinációja történik meg öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezt követően aszkorbát jelenlétében a dioxigén koordinálódik a központi fémionhoz (1). A vas(III)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes az aszkorbát szomszédos szénatomját támadni (2), a sebességmeghatározó lépésben oxovas(IV) intermedier kialakulását eredményezve (3), amely közvetlenül felelős a szubsztrátum aktiválásáért, melynek során egyelektronos oxidáción keresztül iminoil-gyök keletkezik (4). Aszkorbát felesleg esetén az oxovas(IV) intermedier reakciója a szubsztátummal és az aszkorbáttal kompetitív (egymással versengő) reakciót eredményez, amelynek során a kiindulási Fe(II)-komplex és víz keletkezik (5) [95].

Az irodalomban csupán néhány példa található réz-, vas-, mangán- és kobalttartalmú enzim-szubsztrát komplexekre, amelyek oxidációja etilént eredményez, katalitikusan működő rendszer azonban ezidáig nem ismert [96-98].

Simaan és munkatársai a 14. ábrán látható ligandumokkal és szubsztrátumokkal réz(I)-, réz(II)- és vas(III)tartalmú (ES) komplexeket állítottak elő, és vizsgálták reakciójukat hidrogén-peroxid oxidálószerrel. Azt tapasztalták, hogy minden esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékek keletkeznek, tehát ezen komplexek funkcionálisan jól modellezik az ACC oxidáz enzimet. A vizsgálatok során megállapították, hogy bázis (NaOH) hozzáadásával lényegesen növelhető a képződő etilén mennyisége. Ezt azzal magyarázták, hogy bázis hatására a hidrogén-peroxid deprotonálódik, melynek következtében reaktív fém-peroxo komplex alakul ki [99-102].

N N

14. ábra ACC oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok és szubsztrátumok (pa: 2-pikolil-amin; tacn: 1,4,7-triaza-ciklononán; aibH: 2-amino-izovajsav) 2.8. Pirokatechin oxidáz (PO) enzim és modellreakciói

A pirokatechin oxidáz az oxidoreduktázok csoportjába tartozó kétmagvú rézcentrummal rendelkező metalloenzim, amely a pirokatechinek (o-difenolok) oxidatív

dehidrogénezését katalizálja o-kinonná, melléktermékként vizet, vagy hidrogén-peroxidot szolgáltatva (14) [103].

OH OH

O₂

pirokatechin oxidáz

O O

+ H₂O (H₂O₂) (14)

Az enzim növényi szövetekben, rovarokban valamint egyes rákfélékben egyaránt kimutatható. A pirokatechin oxidázt 1937-es első elkülönítése óta számos növényből és gyümölcsből (burgonya, spenót, alma, szőlő, licsi) sikerült kinyerni [104,105], de az enzim röntgendiffrakciós szerkezete csak pár évvel ezelőtt vált ismertté [106].

Az aktív centrumban lévő rézion szerkezete, spektroszkópiai sajátságai alapján három jellegzetes formát különböztethetünk meg: az enzim alapállapotához tartozó ún. met-formát, valamint az oxidált (oxi-) és redukált (deoxi-) formát (16. ábra).

Az édesburgonyából (Ipomoea batatas) elkülönített enzimről megállapították, hogy monomer szerkezetű, molekulatömege 39 kDa, ellipszoid alakú, és mérete hozzávetőlegesen 55 45 45 Å. A fehérje másodlagos szerkezetét hat α-hélix építi fel, amelyek által kialakított üregben, melyet két diszulfid-híd (Cis11–Cis28 és Cis27–Cis89) kapcsol össze a nitrogénben gazdag N-terminális résszel, helyezkedik el az aktív centrum (15. ábra). Az aktív centrumban található réz(II)ionok mindegyikéhez három hisztidin kapcsolódik. A Cu(A)ion a His88, His109 és a His118 imidazolos nitrogénatomjaihoz koordinálódik, a Cu(B)ion pedig a

15. ábra Az Ipomoea batatas-ból elkülönített pirokatechin oxidáz szerkezete [106]

His240, His244 és a His274 aminosavakkal létesít koordinatív kötést. Az egymástól 2,9 Å távolságra lévő réz(II)ionok hidroxo-hídon keresztül kapcsolódnak, trigonális bipiramisos geometriát kialakítva, ahol az apikális pozicióban a His109 és a His240 foglal helyet (15.ábra) [106]. Az enzimről nyert információk birtokában az enzim hatásmechanizmusa a fentiekben említett határformákon keresztül a 16. ábra alapján írható le. Az enzimfolyamat sztöchiometriáját tekintve elmondható, hogy az enzim egy molja két mol szubsztrátumot oxidál és ehhez egy mol dioxigént használ fel. A szubsztrátum oxidációja tehát kétféle módon valósul meg, egyik esetben anaerob, míg a másik esetben aerob körülmények között.

A pirokatechin oxidáz enzim működésének megismerésére és megértésére irányuló tudományos közlemények számos szerkezeti és funkcionális modellt tartalmaznak. Ezen modellek többnyire egy- vagy kétmagvú rézkomplexekre épülnek, melyeket a legváltozatosabb tulajdonságokkal rendelkező ligandumok felhasználásával állítottak elő. Az enzim ismertetése során felvázolt három állapot közül a legtöbb tanulmány a met-formára (17.

ábra) született.

16. ábra Pirokatechin oxidáz feltételezett hatásmechanizmusa

A modellvegyületek között többnyire kétmagvú rézkomplexekkel találkozhatunk (7.

táblázat), melyekben a réz(II)ionok távolsága a ligandum tervezésével és a hídligandumok (µ-OH, µ-RO, µ-O, µ-RCO) helyes megválasztásával tetszés szerint változtatható (18. ábra).

17. ábra A met-forma aktív centrumában kialakuló koordinációs övezet

N N

18. ábra Pirokatechin oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok

A pirokatechinek oxidációja során a legnagyobb katalitikus aktivitás abban az esetben volt megfigyelhető, amikor a rézionok távolsága kisebb, mint 5 Å. Ennek hátterében sztérikus okok állnak, nevezetesen a két réz(II)ionnak olyan távolságban kell lennie egymástól, ami lehetővé teszi a pirokatechin koordinációját (μ-1,2-) és azon keresztüli oxidációját [113]. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tapasztalat is, hogy a kétmagvú komplexek többnyire jobb katalitikus sajátságokkal rendelkeznek, mint egymagvú analógjaik [114,115]. Egyes tanulmányokban az oxidáció sebessége és a rézkomplexek redoxpotenciálja között fennálló kapcsolat lehetősége is felmerült, azonban direkt korrelációt egy esetben sem találtak [116].

Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy az enzimfolyamatban a dirézcentrumnak kétféle kritériumnak kell megfelelnie, a szubsztrátum által könnyen redukálhatónak, a dioxigén által pedig könnyen oxidálhatónak kell lennie.

Az irodalomban mangántartalmú pirokatechin oxidáz modellre is található példa [117-119], ennek oka, hogy a pirokatechin dioxigenázoknak mangántartalmú képviselőjük is ismeretes.

7. táblázat Pirokatechin oxidáz funkcionális modelljei

2.9. Szuperoxid dizmutáz (SOD) enzimek és modellreakcióik

A szuperoxid dizmutázok (SOD) olyan metalloenzimek, amelyek a szervezetben lejátszódó oxidációs reakciók melléktermékeként keletkező szuperoxid gyök-aniont alakítják vízzé és hidrogén-peroxiddá (15) [120]. A szuperoxid gyök-anion önmagában is képes

[Cu2(LO)(OMe)(MeOH)(ClO4)]ClO4[111]

[Cu2(LH2)(MeCN)4](ClO4)6.

diszproporcionálódásra, ennek sebessége azonban nem elegendő ahhoz, hogy a termelődő gyök, károsító hatását megelőzze. A SOD enzimek a diffúziós kontroll hatását elérő sebességgel reagálnak a szuperoxid gyök-anionnal, így ezek az enzimek jelentik az elsődleges védelmet a szervezet számára az oxidatív stressz ellen [121].

M⁽ⁿ⁺¹⁾⁺ + O2 Mⁿ⁺ + O2

M⁽ⁿ⁺¹⁾⁺ + 2H⁺ + O2 M⁽ⁿ⁺¹⁾⁺ + H₂O₂

2H⁺ + O2

2O2 + H2O2

(15)

A SOD enzimek a bennük található fém minősége alapján három csoportba sorolhatók: vannak főként prokariótákban előforduló vas- (FeSOD) [122,123], főként eukariótákban fellelhető réz/cink- (CuZnSOD) [124] és minden élőlényben jelen lévő mangántartalmú (MnSOD) [125] képviselőik. A mangánt illetve vasat tartalmazó enzimek szerkezetéről kiderült, hogy nagyon hasonlóak egymáshoz [126], míg a réz/cink szerkezete az előbbiektől jelentős mértékben eltér [127].

A természetes SOD enzimek hiányos működését, ennek következtében a szuperoxid gyök-anion kumulálódását számos betegség (pl. rák, gyulladásos betgségek stb.) kiváltó okaként tartják számon [128]. Ennek eredményeképpen az utóbbi évtizedben jelentős érdeklődés irányult mesterséges helyettesítők előállítására és vizsgálatára [129-135]. Annak ellenére, hogy Fe, Mn és Cu/Zn tartalmú modelleket egyaránt előállítottak és teszteltek, in vivo helyettesítőként való alkalmazásra leginkább a MnSOD utánzó vegyületek alakalmasak.

Ez főként a szabad Mn(II)-ion kisebb toxicitásának köszönhető A helyettesített penta-aza-ciklusokkal és a salen-ligandumokkal képzett komplexek eljutottak a klinikai tesztekig. [136-139].

2.10. Vas- és mangántartalmú kataláz enzimek és modellreakcióik

Az élő szervezetekben felhalmozódó hidrogén-peroxid bomlási folyamatai a sejtfalra nézve káros, reaktív oxigén szármzékokhoz (szuperoxid, hidroxilgyök stb.) vezethetnek.

Ennek kiküszöbölésére az élő szervezetekben ún. kataláz enzimek (19. ábra) szolgálnak, amelyek a hidrogén-peroxid vízzé és dioxigénné történő reakcióját katalizálják (16). Ezen enzimek a vas-, illetve mangántartalmú metalloenzimek csoportjába sorolhatók.

A kataláz enzimek a szuperoxid dizmutázok mellett a szervezetünk első védelmi vonalát képezik a gyökökkel szemben. Nemcsak az oxidatív stressz ellen nyújtatnak védelmet, hanem megelőzik/megelőzhetik különféle degeneratív betegségek (pl. rák) kialakulását, valamint a sejtöregedést is [140, 141].

2H₂O₂ kataláz 2H₂O + O₂ (16)

19. ábra Az emberi kataláz enzim [142]

A Fe-kataláz enzimek négy polipeptidláncból épülnek fel, egy tetramer molekulát képezve. Egyetlen lánc több mint 500 aminosavból áll. A tetrameren belül 4 hem található, csakúgy, mint a katalázokkal rokon hemoglobin, citokróm és klorofill molekulákban. A Fe-katalázok enzimatikus aktivitásáért a hem felelős, amely egy prosztetikus csoport, a biológiai aktivitást ezen feszített szerkezetnek tulajdonítják.

Valamennyi enzim közül a Fe-kataláz enzimek átalakítási aránya (TON) a legmagasabb: egy molekula enzim 6 millió molekula hidrogén-peroxidot képes vízzé és dioxigénné bontani egyetlen perc alatt.

A hem (20. ábra) egy protoporfirin gyűrűt tartalmaz, közepén egy vasionnal. A protoporfirin gyűrű négy pirrol gyűrűből épül fel melyeket metilén-csoportok kapcsolnak össze. Négy metil, két vinil és két propionát oldallánc kapcsolódik a protoporfirin gyűrűhöz, a gyűrű közepén a vas Fe(II) és Fe(III) formában is megtalálható [143].

Arról, hogy a vas(II)tartalmú komplexek miként bontják a hidrogén-peroxidot, a kutatók már több mint száz éve vitatkoznak, de még mindig nem létezik egységesen elfogadott elmélet. A rengeteg e témával foglalkozó publikáció és a sok elvégzett kísérlet

ellenére, még az sem tisztázott, hogy a vas milyen oxidációs állapotain keresztül játszódik le a folyamat, illetve hogy gyökös, vagy ionos jellegű reakcióról van e szó (17-20).

20. ábra A Fe-kataláz enzimekben található hem szerkezete [143]

Fe²⁺+ H₂O₂ FeO²⁺+ H₂O₂

FeO²⁺+ H₂O Fe²⁺+ H₂O + O₂ Fe(II)-Fe(IV)átmenet (ionos) [144]:

(17)

(18)

Fe²⁺+ H₂O₂ Fe³⁺+^.OH + H₂O Fe²⁺+^.OH Fe³⁺+ H2O Fe(II)-Fe(III)átmenet (gyökös) [145] :

Fe²⁺+ H₂O₂ Fe³⁺OOH Fe⁵⁺=O + H₂O H⁺

Fe(II)-Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [146]:

(19) Oxigén | Szén | Nitrogén | Hidrogén | Vas

Fe³⁺+ HO₂^- [FeOOH]²⁺

[FeOOH]²⁺ HO + FeO³⁺

FeO³⁺+ H2O2 Fe³⁺+ O₂+ H₂O Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [147]:

(20)

A Mn-tartalmú kataláz enzimeket a Thermus thermophilus [148], a Lactobacillus plantarum [149,150] és a Thermoleophilum album [151] baktériumokból izolálták. Ezen enzimek röntgenszerkezete alapján megállapítást nyert, hogy az aktív centrum két egymástól 3,13 Å távolságra lévő mangániont tartalmaznak, melyek karboxiláthídon keresztül kapcsolódnak (21. ábra).

21. ábra A Thermus thermophilus -ból elkülönített kataláz enzim szerkezete [152]

A Mn-katalázokban a két mangán-magot először ESR-spektroszkópiával mutatták ki.

Ezzel a technikával jellemezték a hármas és négyes oxidációs állapotokat is [153-155]. A meghatározott antiferromágneses csatolási állandók alapján szerkezeti modellekkel összehasonlítva már a röntgenszerkezetek ismerete előtt valószínűsítették, hogy az aktív helyen a mangánionok (µ-OH)(µ-karboxilát) híddal vannak összekapcsolva [156]. ESR-rel a Mn (II,II) katalázban található mangánionok antiferromágneses csatolását is sikerült igazolni.

EXAFS spektroszkópiával vizsgálva az egyes oxidációs állapotokat a Mn–Mn távolság észrevehetően lerövidül 2,7 Å-re a katalitikusan inaktív (III,IV) formában. Ez az alak valószínűleg bisz(µ-oxo)-hidat tartalmaz [157]. A Mn-katalázok fiziológiai aktivitását kizárólag csak a (II,II) és (III,III) oxidációs állapotoknak lehet tulajdonítani. A ping-pong

ciklusú mechanizmus a két egymásba könnyen átalakítható oxidációs állapotnak köszönhető (22. ábra) [158, 159].

22. ábra A kétmagvú mangán-katalázok lehetséges mechanizmusa [160]

A mangántartalmú katalázokról spektroszkópiai módszerekkel megállapították, hogy az enzimatikus reakció során redukált Mn(II,II), illetve oxidált Mn(III,III) formában vannak jelen. A vegyes oxidatív állapotok az enzimatikus reakcióban nem játszanak szerepet [158].

A reakció első lépésében a szubsztrátum közvetlenül az ún. terminális (szélső) oldali Mn(II)-t támadja meg, leszorítva onnan a vízmolekulát (A→B, 22. ábra). Az internális (belső) oldali fehérjerész karboxilát csoportja protonpuffer funkciót tölt be, deprotonálja a H2O2-t, majd később átad egy protont, és ezáltal tud víz képződni. A koordinált peroxid terminális helyzetből (B) elfordul, majd a µ-η²–peroxo-híd képződik (C). A szubsztrátum redukálódik, víz lép ki, és a mangánionok távolsága lecsökken ~3,6 Å-ről 3,1 Å-re (C→D). A továbbiakban a µ-oxo-híd protonálásával a híd felhasad és újabb szubsztrátum molekula lép a koordinációs övezetbe (D→E). Ezután intramolekulárisan két elektron kerül a dimangán(III) centrumra a terminálisan koordinált peroxidról, ami dioxigén fejlődéséhez és az enzim redukált formájának visszanyeréséhez vezet (E→A). Az enzimatikus reakció spontán lejátszódását biztosító negatív szabadenergia-változás az elektronátadásokat kísérő, azokkal

csatolt protontranszfer-reakciók kedvező energiamérlegének tudható be. A protonpufferként jelen lévő nem koordinált karboxilát funkció pKa értéke ugyanis az elképzelések szerint a ciklust kísérő töltéseloszlás változások miatt megváltozik a két részfolyamatban (A→B→C→D és D→E→A) [160]. Egy alternatív mechanizmus egymásba kölcsönösen átalakuló Mn2II(µ-OH2) és Mn2III(µ-O)2 intermedierekre alapozza a katalitikus ciklust [161].

A fenti enzimeknek direkt felhasználása gyógyászati célokra korlátozott, a sejtmembránok alacsony permeabilitása és a nagy molekulatömeg következtében. Az irodalomban számos példa található különféle átmenetifém-tartalmú (Cu, Fe, Mn) komplexekre, amelyeket a kataláz enzimek szerkezeti és/vagy működési modelljeiként vizsgáltak [162-172].

3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

3.1. Vas- és mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz modellek

A 2.6. fejezetben felvázolt előzmények alapján célkitűzésünk az volt, hogy vas- és mangántartalmú funkcionális modelleket dolgozzunk ki, melyek tanulmányozásával betekintést nyerhetünk mind a szubsztrátum-, mind a dioxigénaktiválás mechanizmusába. A kapott eredmények összevetése a korábban vizsgált réztartalmú enzimmodell rendszerekkel az átmenetifémek enzimekben betöltött szerepére nézve is hasznos információt nyújthatnak.

A növényi világban előforduló antioxidáns sajátságokkal rendelkező flavonolok komplexképző (kelátképző) sajátságáról szerzett ismeretek – a fenti szempontok mellett – mind az élelmiszeriparban, mind a gyógyászatban felhasználhatók, a szervezet számára nélkülözhetetlen nyomelemek (pl. vas, mangán) bevitelének tervezése során.

3.1.1. Szintetikus Fe(III)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése

A korábbiakban (2.6. fejezet) ismertetett enzimológiai és modellvizsgálatok alapján valószínűsíthető, hogy a kvercetin oxidatív dekarbonilezési reakciója a szubsztrátum koordinációjával, majd az azt követő aktiválásával indul. A dioxigénezés – feltételezések szerint – az így kialakuló reaktív komplexen keresztül valósul meg. Ennek bizonyítása

In document Oxireduktáz enzimek modellreakcióinak vizsgálata (Pldal 26-0)