Kísérleti rendszerek

A gazda–parazita kölcsönhatás fejlődéstani hátterét két fajon, az erősen patogén M. cerebralis, és az alacsony patogenitású, klinikai tüneteket és elhullást általában nem okozó M. pseudodispar fajon vizsgáltuk.

2.1. ábra: Két modell faj, a M. cerebralis és a M. pseudodispar életciklusának fenntartása zárt laboratóriumi rendszerben. A: M. cerebralis-sal fertőzött sebes pisztrángok (Salmo trutta m fario) és szivárványos pisztrángok (Onchorhynchus mykiss); B: SPF bodorkák (Rutilus rutilus); C: Tubifex spp.

egyedi fertőzése M. pseudodispar spórákkal; D: M. cerebralis-sal fertőzött kevéssertéjű féregállomány.

Melléklet: M. pseudodispar myxospóra és M. cerebralis TAM.

A paraziták minden esetben zárt laboratóriumi rendszerben fenntartott állományból származtak (2.1. ábra). A halak fertőzése minden kísérletben egyedileg történt, és a negatív kontroll csoport egyedeit a fertőzött csoportokhoz hasonló módon kezeltük, annyi különbséggel, hogy a parazitával nem kerültek kontaktusba.

M. pseudodispar gazdafajlagossága kevéssertéjű féreg gazdában (Marton & Eszterbauer 2012)

Négy különböző laboratóriumi tenyészetből (T-I és T-II, AU, és WS) származó kevéssertéjű férgeket egyedileg fertőztünk 10³-10⁴ db myxospóra/féreg dózisban 1,5 ml autoklávozott iszapot tartalmazó 2 ml-s műanyag mikrocsövekben, amik 5 literes vízzel teli és levegőztetett műanyag edénybe voltak helyezve a 2.1. C ábrán látható módon. A kísérlet kezdetétől számított 1., 4., 8. és 24. óra végén, majd az 1., 4. hét végén 5-5 féreg egyedet fixáltunk molekuláris és ISH vizsgálatokhoz. A harmadik hónap végén az összes maradék egyedet fixáltunk a parazita spóra ürítés vizsgálatára és molekuláris vizsgálatokhoz.

M. pseudodispar gerinces gazdaspektrumának vizsgálata (Forró & Eszterbauer 2013) Két kísérleti elrendezésben fertőztünk pontyféléket. Az elsőben 1 éves bodorka, 2 éves dévérkeszeg, és 3 éves vörösszárnyú keszeget fertőztünk 3000 TAM/hal dózisban 3 órán keresztül (16 hal/csoport), míg a második kísérletben 1 éves bodorka és szintén 1 éves vörösszárnyú keszeg egyedek fertőzöttségét hasonlítottuk össze az első kísérlettel azonos körülmények között (20 hal/csoport). A 3 órás inkubáció letelte után a halakat csoportonként külön akváriumba helyeztük a kísérlet végéig. A boncolás és a parazita spórák számolása a fertőzést követő harmadik hónap végén történt.

M. cerebralis gazdafelismerése és gazdába való bejutása (Kallert et al. 2009)

A fertőzési kísérlet során 11 hónapos szivárványos pisztráng (TroutLodge, TL és Hofer, H törzsek) és ponty egyedeket fertőztünk 8000 TAM/hal dózisban 3 percen keresztül (9 db hal/csoport; 9 ismétléssel). Előzetesen a M. cerebralis TAM-okat 5 mg/ml fluoreszcein-diacetát (FDA) festékkel jelöltük Yokoyama & Urawa (1997) leírását követve, hogy a parazita halba való bejutása fluorescens mikroszkóp segítségével detektálható legyen. Az inkubáció lejárta után, a halak bódítását és kiirtását követően azonos méretű kopoltyú, mellúszó, farokúszó darabban, és azonos mennyiségű bőrkaparékban mikroszkóppal vizsgáltuk a parazita jelenlétét. A parazita DNS mennyiségét valós idejű, kvantitatív PCR (qPCR) segítségével becsültük meg.

M. cerebralis gazdába való bejutásának lokalizációja (Eszterbauer et al. 2019)

A kísérletben 7–8 hetes szivárványos és sebes pisztráng, valamint 12 hónapos ezüstkárász egyedeket fertőztünk 10000 TAM/hal dózisban 2 órán keresztül (21 db hal/csoport). Az inkubációs idő (2 óra) letelte és a halak túlaltatása után, egységnyi mennyiségű kopoltyú-, farokúszó-, és a test oldaláról származó bőrmintát gyűjtöttünk a molekuláris vizsgálatokhoz.

M. cerebralis gazdafelismerésének molekuláris háttere (Eszterbauer et al. 2009)

A M. cerebralis TAM gazdafelismerésének hal jelenléte nélküli vizsgálatára in vitro aktivációs módszert dolgoztunk ki. A kísérleti spóraszuszpenzió koncentrációja 10000-75000 TAM/ml volt. Ebből 400-400 µl-t pipettáztunk 24-lyukú szövettenyésztő lemezek mélyedéseibe.

Szivárványos pisztráng bőrnyálka kaparékból nyálka-kivonatot készítettünk Kallert et al.

(2005) leírását követve. A TAM szuszpenzió aktiválása 0,7 mg/ml végkoncentrációjú nyálka kivonat hozzáadásával (kémiai inger) és 3x2 másodperc intenzív vortexeléssel (mechanikai inger) történt. A TAM-ok aktivitását 15 perccel az aktiválást követően 3x20 µl térfogatú szuszpenzióban lévő aktív (kiszabadult sporoplazma) és aktiválatlan TAM-ok (ép, intakt spóra) mikroszkópos számolásával vizsgáltuk 10 ismétlésben. Majd statisztikailag értékeltük a módszer hatékonyságát. A későbbi molekuláris vizsgálatokhoz ezzel az aktivációs eljárással, 30 perccel az aktiválást követően gyűjtöttük az aktivált és ugyanennyi idő elteltével az ingerek hatása nélkül tartott (kontroll) TAM mintákat (800.000 TAM/minta mennyiségben), és RNAlaterben (Sigma-Aldrich; Merck) fixálva, –20°C-on tároltuk felhasználásig.

A génexpressziós vizsgálatokhoz az aktivált és a kontroll TAM mintákon kívül a parazita halban fejlődő alakjainak korai stádiumait is vizsgáltuk. Ehhez egyedileg fertőztünk 12 hetes TroutLodge (TL) szivárványos pisztrángot 30 percig, 3500 TAM/hal dózisban, és 6-6 egyed bőrnyúzatát fixáltuk RNAlaterben 1, 8 és 24 órával a fertőzést követően.

Halak beltenyésztettségének hatása a M. cerebralis fertőzöttségre (Eszterbauer et al.

2015)

A fertőzési kísérletben 10 hetes, különböző beltenyésztettségi szintű sebes pisztráng ivadék négyféle csoportját fertőztünk. Egy genetikailag heterogén (NIB), egy beltenyésztett (IB), egy közeli rokon hím-nőstény párok utódaiból álló (REL), és egy, Európában igen gyakori, atlanti-dunai hibrid vérvonal (LBT) egyedeit magába foglaló csoportot alakítottunk ki. Pozitív kontrollként szivárványos pisztráng csoport szolgált a kísérletben. Az egyedi fertőzés 3000 TAM/hal dózisban 3 órán keresztül történt (53 db hal/csoport). A fertőzést követően a halak csoportonként külön akváriumba kerültek a kísérlet végéig. A boncolás és a parazita spórák számolása a fertőzést követő negyedik hónap végén történt.

Kevéssertéjű férgeket fertőztünk bodorkából, vörösszárnyú keszegből, dévérkeszegből és karikakeszegből származó M. pseudodispar myxospórákkal külön-külön. A féregtenyészetek parazita TAM ürítését a fertőzést követő második hónaptól heti rendszerességgel vizsgáltuk.

Vér szerepe a M. cerebralis és a M. pseudodispar fertőzöttségben (Sipos et al. 2018) Három kísérletet végeztünk, egyet M. cerebralis fajjal, kettőt M. pseudodispar fajjal. Nyolc hetes szivárványos pisztrángot és sebes pisztrángot fertőztünk M. cerebralis-sal. Az első

M. pseudodispar kísérletben 1 éves bodorkát, vörösszárnyú keszeget és ezüstkárászt, a második kísérletben 2 éves bodorkát és 2 éves vörösszárnyú keszeget, és 3 éves dévérkeszeget fertőztünk. Mindhárom kísérletben 5000 TAM/hal dózisban 3 órán keresztül egyedileg fertőztük a halakat (34 db hal/csoport). A fertőzés inkubációs idejének lejárta után halfajonként külön akváriumba helyeztük a halakat, majd a kísérlet kezdetét követően 1 nappal, 1 héttel és 1 hónappal 10-10 halból bódítást követően vért vettünk a farki vénán keresztül. A vérmintákban lévő parazita fejlődési alakok mennyiségét, fajspecifikus, valós idejű qPCR segítségével becsültük.

Nyálkaspórás fertőzés megelőzésének lehetőségei (Kallert et al 2014)

A nyálkaspórások halgazdába való bejutását akadályozó módszereket vizsgáltunk in vitro és in vivo tesztekben.

In vitro tesztek: Kurauchi et al. (2004) szabadalma alapján elkészített inozin és arginin sók keverékét (IA) teszteltük M. cerebralis és M. pseudodispar fajokon. Az érett, fertőzőképes TAM-ok gazdafelismeréskor jelentkező reakcióját (konkrétan poláris filamentumaik kilökődését és a sporoplazma aktív kijutását) vizsgáltuk két külön kísérletben 6–6 ismétléssel.

In vivo kipróbálás: Az in vitro kísérletekben hatékony koncentrációjú IA sóoldattal 20 percig inkubált M. pseudodispar TAM-mal fertőztünk bodorkát 1000 TAM/hal dózisban 3 órán keresztül. A kísérlet pozitív kontrollja nem sóoldatban, hanem vízben inkubált TAM-mal fertőzött halcsoport volt. A halakat a fertőzést követő harmadik hónap végén boncoltuk, és a kifejlődött parazita myxospórákat Bürker kamrában számoltuk.