4.3. Az újonnan előállított szteroid alkinek (90‒94, 102, 103) CuAAC reakciói
4.4.2. Jódszteroidok Sonogashira keresztkapcsolási reakciói
Munkánk folytatásában a kiválasztott jódvegyületek palládium katalizálta keresztkapcsolását valósítottuk meg. Mivel az irodalomban ismert a 2-feniletinil-ösztron (50) 17-HSD1 enzim inhibitor hatása,23 mi is a fenilacetilént és annak különböző p-szubsztituált származékait kívántuk használni. A fenilacetilének szubsztituenseit úgy választottuk meg, hogy azok eltérő elektroneloszlást eredményezzenek az aromás gyűrűn. A lehetőleg rézmentes Sonogashira kapcsolások kivitelezését mikrohullámú eljárás kidolgozásával terveztük.
Először az acetilezett származékokat (134, 135) vittük kapcsolási reakcióba. A megfelelő reakciókörülmények kidolgozását, optimalizálását az oxim-diacetáttal (135a) és a szubsztituálatlan fenilacetilénnel (139a) kezdtük (II. Táblázat). Elsőként az irodalomban egyik legelterjedtebb katalizátort, a tetrakisz(trifenilfoszfán)palládium(0)-t (Pd(PPh3)4) és réz(I)-jodidot (CuI) alkalmaztuk.194,195 Oldószerként dimetil-formamidot (DMF), bázisként trietilamint (NEt3) választottunk. A reakcióelegyet több órán keresztül, 100 °C-on kevertetve sem tapasztaltuk a kapcsolt termék képződését. A tercier amint szekunder aminra (NH(iPr)2) cserélve, bázisként, ill. bázis és oldószerként alkalmazva sem volt megfigyelhető átalakulás.
Ezt követően palládium(0)- helyett, palládium(II)-katalizátor és foszfán ligandum hozzáadásával próbáltuk megvalósítani a Sonogashira kapcsolást. Az elegyhez minden esetben az erélyes palládium(II)-acetátot (Pd(OAc)2) és egy nagy térkitöltésű, elektronban gazdag foszfán ligandumot (cataCXium A) adtunk. A foszfán feladata egyrészt a fém elektronsűrűségének növelése, másrészt az izomerizáció előkészítése volt. Előbbinek az oxidatív addíciós, utóbbinak a reduktív eliminációs lépésnél van fontos szerepe. Az irodalom szerint az ilyen rézmentes kapcsolásoknál a szekunder aminok a leghatékonyabbak. A reakcióelegyeket 30 percig, 100 °C-on reagáltatva mikrohullámú reaktorban, 2-feniletinil-ösztron származék (140) csak NEt3 bázis jelenlétében képződött (61. ábra).
66
II. Táblázat: A Sonogashira kapcsolás reakciókörülményeinek optimalizálása a 135a-ös diacetát származékra
Katalizátor Ligandum Oldószer Bázis Termék Hozam(%)
Pd(PPh3)4/CuI - DMF NEt3 - -
Pd(PPh3)4/CuI - DMF NH(iPr)2 - -
Pd(PPh3)4/CuI - NH(iPr)2 NH(iPr)2 - -
Pd(OAc)2 cataCXium A THF NH(iPr)2 - -
Pd(OAc)2 cataCXium A DMF NEt3 140 60
Az oxim 4-jódszármazékából (135b) kiindulva, a C-2-izomerével (135a) megegyező körülmények között jutottunk a Sonogashira-termékhez (141, 61. ábra).
61. ábra Acetilezett jódszármazékok (135a, b) reakciója fenilacetilénnel
A reakció körülményei között azonban a kapcsolással egyidejűleg az oxim-acetát (135) dezacetileződött (142), majd vízelimináció révén nitrillé alakult (143, 62. ábra).
62. ábra A nitril funkció (143) kialakulásának feltételezett mechanizmusa
67
Kutatócsoportunk korábbi eredményei alapján tudjuk, hogy a 17-nitril funkció kialakulása általában az antitumor hatás csökkenését vonja maga után,196 ezért az oxim-acetátok Sonogashira-reakcióitól a későbbiekben eltekintettünk.
A jódozott D-szekoalkohol diacetátjának (134a) kapcsolását a szubsztituálatlan fenilacetilénnel (139a), az oxim-diacetátoknál (135) alkalmazott körülmények között hajtottuk végre (63. ábra). Az alkohol származék (134a) reakciójánál nem tapasztaltunk dezacetileződést, sem egyéb szteroid jellegű melléktermék keletkezését. Ezért ezt követően a szubsztituált fenilacetilénekkel (139b‒d) is elvégeztük a keresztkapcsolást. A felhasznált fenilacetilének (139b‒d) p-helyzetű szubsztituensei eltérő elektronikus sajátságokkal rendelkeztek: elektronküldő (-CH3, -OCH3) és elektronszívó (-F, -CF3) hatással. Az elért hozamokat a Mellékletek VII. Táblázata tartalmazza, melyből látható, hogy a szubsztituálatlan (144a), illetve elektronküldő csoportot tartalmazó fenilacetilénekkel (144c,d) jobb konverziókat sikerült elérni, mint az elektronszívó p-fluor csoport (144b) esetén. A reakcióelegyeket minden esetben 30 percig, 100 °C-on reagáltattuk mikrohullámú reaktorban. A feltüntetett hozamokon a mikrohullámú melegítés időtartamának növelésével nem tudtunk javítani. A termékek (144a‒d) tisztítását a reakcióelegy feldolgozása nélkül, flash kromatográfiával végeztük 15% etil-acetát/hexán eluenssel.
63. ábra A jódozott D-szekoalkohol diacetátjának (134a) fenilacetilénekkel (139a‒d) való keresztkapcsolása
A keresztkapcsolási reakciókat a 3-metil-éter sorban folytattuk. Az 5.1-es és 5.2-es fejezetben tárgyaltak és kutatócsoportunk eredményei197 alapján ugyanis a 3-metil-éter védett oxim (23) is ígéretes modellvegyület lehet antitumor hatóanyagok kifejlesztéséhez. A 3-metiléter sorban a jód helyzete döntően befolyásolta a kapcsolási reakció körülményeit. A
2-68
es és a 4-es regioizomerek (136a és b) esetén különböző reakciókörülmények kidolgozására volt szükség (64. ábra). A 3-metil-éter-D-szekooxim 2-jód izomere (136a) a diacetátjánál (135a) alkalmazott katalizátor és oldószer mellett nem reagált a fenilacetilénnel (139a, III.
Táblázat). A Pd(OAc)2-ot először a szintén második oxidációs állapotú palládiumot tartalmazó, bisz(trifenilfoszfin)palládium(II)-kloridra (Pd(PPh3)2Cl2) cseréltük. A szteroidot (135a) és a katalizátort THF-ben oldva, sem DIPEA, sem NEt3 jelenlétében nem volt átalakulás 100 °C-on. Katalizátorként Pd(PPh3)4-t alkalmazva sem tapasztaltunk termékképződést, azonban a CuI segédkatalizátor hozzáadása a várt terméket (145a) szolgáltatta (64. ábra). Továbbá a reakciókörülmények optimalizálása során azt is megállapítottuk, hogy a hőmérséklet 60 °C-ra csökkentésével teljes mértékben kiküszöbölhető az oxim funkció nitrillé alakulása.
III. Táblázat: A reakciókörülményeinek optimalizálása 3-metil-éter jódvegyületre (136a) Katalizátor Ligandum Oldószer Bázis Termék Hozam(%)
Pd(OAc)2 cataCXium A DMF NEt3 - -
Pd(PPh3)2Cl2 - THF DIPEA - -
Pd(PPh3)2Cl2 - THF NEt3 - -
Pd(PPh3)4 - THF NEt3 - -
Pd(PPh3)4/CuI - THF NEt3 145a 68
A sztérikusan gátoltabb 4-jód izomer (136b), akárcsak a diacetátja (135b), az erélyesebb Pd(OAc)2 katalizátor jelenlétében, rézmentes körülmények között alakult a megfelelő fenilalkinil származékká (146a, 64. ábra). Így a továbbiakban a p-helyzetben szubsztituált fenilacetilénekkel (139b‒e) is végrehajtottuk a Sonogashira kapcsolási reakciókat.
69
64. ábra A 2- és 4-jód regioizomerek (136a, b) Sonogashira keresztkapcsolása az oxim 3-metil-éter sorban
A reakciók sikerességét 1H és 13C-NMR spektroszkópiával igazoltuk. A 145c jelű vegyület 1H és 13C-NMR spektrumának részletein is jól láthatók az újonnan beépülő csoporthoz és az oxim funkcióhoz tartozó protonok és szénatomok jelei (65. ábra). A 1 H-NMR spektrumon 3,8 és 4 ppm között 2 db háromszoros intenzitású szingulett látható, amely a p-metoxi-fenilacetilén beépülésére utal. 6,8 és 7,5 ppm körül megfigyelhető egy-egy kétszeres intenzitású dublett, amelyek az 1,4-diszubsztituált fenilcsoport protonjaihoz rendelhetők. A megfelelő aromás CH jelek a 13C-NMR spektrumon 110 és 130 ppm fölött mutatkoznak, az acetilén kvaterner szenei pedig 85 és 95 ppm között.
70
65. ábra A 145c jelű vegyület 1H- és 13C-NMR spektrumának részletei (CDCl3)
A következő célunk az volt, hogy a 3-metil-éterekre kidolgozott mikrohullámú Sonogashira kapcsolásokat kiterjesszük a 3-hidroxi-vegyületekre is. A szabad fenolos hidroxilcsoport jelenléte az irodalmi előzmények alapján szükséges a 17-HSD1 inhibitor hatás kialakulásához. A 3-hidroxi származékok 2-jódvegyületeit (137a, 138a) azzal az eljárással alakítottuk tovább, amelyet a 3-metil-éter sor 2-jódvegyületeinél (136a) dolgoztunk ki. A D-szekoalkohol és -oxim jodidja (137a, 138a) azonos körülmények között, palládium-tetrakisz-trifenilfoszfán (Pd(PPh3)4) katalizátor, réz(I)-jodid kokatalizátor és trietilamin bázis jelenlétében, tetrahidrofurán oldószerben szolgáltatta a várt ösztron-acetiléneket (147, 148, 66. ábra). A kapcsolási reakciók itt is a szubsztituálatlan (139a), illetve elektronküldő csoportot tartalmazó fenilacetilén (139c,e) alkalmazása esetén játszódtak le a legnagyobb konverzióval (Mellékletek VII. Táblázat). Ugyanekkora hozam eléréséhez a dezaktiváló
ppm
71
p-fluor- (139b) és p-trifluormetil-csoport (139d) esetén növelni kellett a mikrohullámú besugárzás időtartamát 40 percre.
66. ábra 3-Hidroxi-D-szekoösztronok 2-jód vegyületeinek (137a, 138a) Sonogashira-kapcsolása
A Mellékletek VII. Táblázatában szereplő hozamokat minden esetben a flash kromatográfiás tisztítást követően határoztuk meg. A szteroid 3-as és 17-es szénatomján lévő csoport nem, de a fenilacetilén p-helyzetű szubsztituense nagymértékben befolyásolta azt. A katalitikus ciklus sebességmeghatározó lépése az oxidatív addíció, amelynek sebességét a szerves halogénvegyület szubsztituensei, ill. térkitöltése befolyásolja.87−91,102,103
Mivel minden esetben a legjobb távozó csoportot tartalmazó jódszármazékokból (134‒138) indultunk ki, a szteroid szerkezete nem befolyásolta jelentősen az átalakulás mértékét. Az acetilén partner (139) szubsztituensének elektronikus és sztérikus tulajdonságai azonban a reduktív eliminációs lépésre vannak hatással.97−99 Azok a szubsztituensek, amelyek elektronküldők: -CH3, -OCH3, kedveznek a redukciós elimináció lejátszódásának. Így azoknál a reakcióknál, ahol p-helyzetben ilyen csoporttal szubsztituált fenilacetilént (139c, e) alkalmaztunk, nagyobb konverziót értünk el azonos reakciókörülmények között.
Az irodalomban elsőként valósítottunk meg mikrohullám-melegítéses Sonogashira-reakciót ösztrán vázas jódvegyületekből kiindulva.
72 4.5. „One-pot” Sonogashira-„click”-reakció
Kutatómunkám első részében a D-szekooxim és a 13-ösztron fenolos hidroxilcsoportjára N-benziltriazolilmetil-egységet beépítve olyan származékokat nyertünk (107, 109), amelyek hatékonyan gátolták több humán tumoros sejtvonal osztódását. Ez alapján indokolt lehet ugyanezen molekularészletnek a D-szekooxim, ill. a 13-ösztron alapvegyület más pozíciójába történő beépítése is. Mivel az irodalomban ismertek 2-es helyzetben szubsztituált antitumor hatású ösztron származékok,23 célunk volt a D-szekooxim és a 13-ösztron 2-es szénatomján a triazol heterociklust tartalmazó egység kialakítása. Az így képződő származékok 17-HSD1 enzimgátlás szempontjából is ígéretesek lehetnek. A Möller és munkatársai által szintetizált, 2-es szénatomon apoláris csoportot (fenilalkinil vagy fenilalkil) tartalmazó vegyületkhez képest az általunk tervezett vegyületek egy poláris, H-kötések kialakítására alkalmas triazol linkeren keresztül tartalmazzák az apoláris benzilcsoportot.
Olyan származékok in vitro vizsgálata, amelyek a 2-es szénatomon közvetlenül nagy poláris triazol linkeren keresztül tartalmazzák a lipofil csoportot, fontos szerkezet-hatás összefüggéseket szolgáltathatnak. A triazol linkert egy kismolekulákra már alkalmazott „one-pot” eljárás179 (ld. 2.5. fejezet, 32. ábra) szteroidokra történő kiterjesztésével kívántuk kialakítani, mikrohullámú reaktorban. A tervezett „one-pot” reakciósor megvalósításához acetilén reakciópartnerként az irodalmi előzmények alapján a trimetilszilil-acetilént (TMSA) választottuk. A szintézis három lépésben történik: 1. az acetilén Sonogashira kapcsolása, 2.
deszililezés, 3. „click”-reakció. Az első és a harmadik reakciólépés mikrohullámú besugárzással történik. A TMSA keresztkapcsolására a különböző alapvázak esetében különböző mikrohullámú módszer kidolgozása volt szükséges. A katalizátor megválasztásában segítségünkre voltak a fenilacetilénekkel megvalósított Sonogashira-kapcsolások közben szerzett tapasztalatok. Az oldószer kiválasztásánál az elsődleges szempont az volt, hogy mindhárom reakciólépés számára megfelelő legyen, és minden lépés jó hozammal játszódjon le benne. Az oxim (136a) esetében a TMSA kapcsolása a fenilacetiléneknél alkalmazott körülmények között kvantitatívan lejátszódott (67. ábra). A köztitermék alkinil származékot (149) izolálás nélkül alakíottuk tovább a következő két lépésben. A szilil védőcsoport eltávolításához tetrabutil-ammónium-fluoridot (TBAF) adtunk a reakcióelegyhez (150), majd rövid, szobahőmérsékleten történő kevertetés után, hozzáadtuk a „click”-reakcióhoz szükséges réz(I)-jodid katalizátort és a p-szubsztituált benzilazidot (104).
73
A várt 2-(N-benziltriazolil)-származékokat (151) újabb mikrohullámú besugárzás után nyertük. A cikloaddíciók ‒ a korábban tárgyalt hagyományos melegítéssel kivitelezett „click”-reakciók során tapasztaltakkal megegyezően ‒ a p-helyzetű szubsztituens minőségétől függetlenül regioszelektíven és jó hozammal szolgáltatták a céltermékeket (151).
67. ábra A D-szekooxim 2-triazolil-származékának (151) „one-pot” szintézise
A 13-ösztron (55a) Sonogashira kapcsolásához a kutatócsoportunkban korábban alkalmazott körülmények ‒ Pd(PPh3)4/CuI katalizátorok és diizopropil-amin dimetil-formamidos elegye201 ‒ nem bizonyult hatékonynak (IV. Táblázat). A reakcióelegyeket minden esetben 100 °C-on, 10 percig reagáltattuk mikrohullámú reaktorban. A reakció lejátszódását vékonyréteg-kromatográfiásan követtük és szükség esetén növeltük a reakcióidőt. A tesztreakciókat a korábban jól bevált NEt3-nal, illetve DIPEA-val és DMF helyett THF oldószerrel folytattuk. Mivel továbbra sem tapasztaltunk átalakulást, a következőkben a 0-s oxidációs állapotú palládium katalizátort palládium(II)-sókra cseréltük.
Az irodalom szerint a Pd(OAc)2, DABCO (1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktán) rendszer kevésbé érzékeny levegőre és vízre.198 A szteroid (55a), a katalizátor és a bázis keverékét acetonitrilben oldva, a várt 2-alkinil termék képződése azonban nem volt megfigyelhető. A palládium acetát sóját bisz(trifenilfoszfin)palládium(0)-biszklórra (Pd(PPh3)2Cl2) változtatva, THF és NEt3 jelenlétében199 nem játszódott le a kapcsolási reakció. Azonban a THF-nél jóval
74
nagyobb dipólusmomentummal rendelkező acetonitril és DABCO alkalmazásával,200 réz- és aminmentes körülmények között kaptuk a várt 2-(trimetilszilil)acetilén származékot (153, 68.
ábra).
IV. Táblázat: Az 1. lépés körülményeinek optimalizálása a 13-ösztronon (55a)
Katalizátor Ligandum Oldószer Bázis Termék Hozam(%)
Pd(PPh3)4/CuI - DMF NH(iPr)2 - -
Pd(PPh3)4/CuI - DMF NEt3 - -
Pd(PPh3)4/CuI THF DIPEA - -
Pd(OAc)2 - ACN DABCO - -
Pd(PPh3)2Cl2 - THF NEt3 - -
Pd(PPh3)2Cl2 - ACN NEt3 - -
Pd(PPh3)2Cl2 - ACN DABCO 153 68
Az intakt D-gyűrűnek köszönhetően nem kellett tartani mellélreakcióktól, ezért erélyesebb körülmények (magasabb hőmérséklet és nagyobb mennyiségű bázis) alkalmazására volt lehetőségünk. Így a 13-epi-ösztron 3-metil-éterének keresztkapcsolását nemcsak 2-jód (55a), hanem 2-brómszármazékából is megkíséreltük. A brómszteroidot N-brómszukcinimiddel, diklórmetánban állították elő csoportunkban (68. ábra).153
68. ábra A 13a-ösztron 3-metil-éterének (4b) brómozása
A 152a jelű vegyület Sonogashira kapcsolásához a korábban is jól működő, Pd(OAc)2/cataCXium A katalizátor/ligandum páros bizonyult hatékonynak, ill. a hosszabb reakcióidő (153, 69. ábra). Brómszteroidok és fenilacetilének mikrohullámú Sonogashira kapcsolására az irodalomban nem található példa.
75
69. ábra A 13-ösztron 2-triazolil származékainak (154) előállítása 2-halogenidek (55a, 152a)
„one-pot” reakciójával
A reakciók sikerességét 1H- és 13C-NMR spektroszkópiai módszerekkel igazoltuk. A köztitermék trimetilszilil-kapcsolt vegyületet (153) egy esetben, a 13-epi-ösztron 3-metil-éteréből előállítva izoláltuk és jellemeztük. A 70. ábra a kiindulási jódvegyület (55a), a 2-(trimetilszilil)acetilén (153) és a 2-(N-benziltriazolil)-származék (154a) 1H-NMR spektrumait mutatja. Az 1. lépés sikerességét a szilil-védett alkin (153) 1H spektrumán 0,2 ppm-nél megjelenő kilencszeres intenzitású szingulett bizonyítja, amely a védőcsoport három metilcsoportjának protonjaihoz tartozik. A 2-es helyzetben lévő jód alkinilcsoportra cserélése az aromás A-gyűrű protonjeleinek (1-H és 4-H) kémiai eltolódását csak minimálisan befolyásolta. A következő két lépés lejátszódását a 154a jelű vegyület NCH2- és benzilcsoportjának protonjaihoz tartozó multiplettek igazolják, 5,5 és 7,3 ppm körül. Jól megfigyelhető továbbá az 1-es szénen lévő proton jelének magasabb kémiai eltolódása (8,2 ppm), amely szintén a szomszédos triazol-gyűrű jelenlétére utal.
76
70. ábra A 13-epi-ösztron 2-szubsztituált származékainak (55a, 153, 154a) 1H-NMR spektrumai (CDCl3)
Hatás-szerkezet összefüggések felállítása céljából a megfelelő 3-hidroxi jódvegyületekből (54a, 138a) kiindulva is megkíséreltük a 2-triazolil-ösztronok előállítását.
Reakciópartnerként a szubsztituálatlan (104a) és a p-nitro-benzilazidot (104e) választottuk.
Választásunkat az indokolta, hogy a 3-propargil-éterek esetében az előbbivel képzett konjugátumok (107a, 109a) voltak a legjobb sejtosztódás gátlók, míg az utóbbival (107e, 109e) a legkevésbé antiproliferatívak. Továbbá a savamid származékok közül a p-nitro szubsztituált (110ae) és a szubsztituálatlan (110aa, 111ba) benzilcsoportot tartalmazó
ppm
77
triazolok a legjobb 17-HSD1 enzimgátlók, 1‒5 M IC50 értékekkel (X. Melléklet). Az oxim vázat (138a) az eddig alkalmazott reakciókörülmények megváltoztatása nélkül sikeresen alakítottuk át (155, 70. ábra). A 13-epi-ösztron 3-hidroxi jódvegyületét (54a) azonban nem sikerült a 3-metil-éterén (55a) optimalizált körülmények között reagáltatni. A következőkben ezért a 3-hidroxi-D-szekoösztron jódvegyületeknél (137a, 138a) bevált katalizátor-bázis-oldószer kombinációt használtuk a TMSA kapcsolásához (71. ábra). Így a korábban alkalmazott 100 °C-os hőmérsékletet (55a, 68. ábra) 60 °C-ra csökkentve jutottunk a kívánt 2-triazolil-származékhoz (156).
71. ábra A „one-pot” reakciósor alkalmazása fenolos A-gyűrűn
78 5. Az előállított vegyületek biológiai hatása