Esettanulmányok
E.1. A kis populációkban érvényesülő evolúciós hatások tanulmányozása 1. Genetikai sodródás
E.1.2.1. A finom genetikai struktúra tanulmányozása az Euphydryas maturna egyik nyírségi populációjában
A fejezet a következő cikk alapján készült:
Pecsenye, K., Tóth, A., Bereczki, J., Tóth, J.P., Varga, Z. 2017. A possible genetic basis for vulnerability in Euphydryas maturna (Lepidoptera: Nymphalidae). Genetica 145(2): 151–161. (IF:
1.343)
Elméleti háttér
A díszes tarkalepke, E. maturna egy regionálisan és szezonálisan oligofág faj (Wahlberg, 2000; Eliasson & Shaw, 2003; Konvička et al., 2005; Freese et al., 2006; Dolek et al., 2012). A nőstények 1-2 petecsomóban rakják le petéiket különböző fás szárú növények leveleire, hazánkban elsősorban Fraxinus és Ligustrum fajokra (Weidemann, 1985; Vrabec, Čížek, O., & Beneš, J., 2002b; Freese et al., 2006; Dolek et al., 2007). A fiatal lárvák fészket szőnek maguk köré, és abban közösen táplálkoznak (Weidemann, 1985; Wahberg, 2000; Vrabec et al., 2002b; Freese et al., 2006; Dolek et al., 2012). Nyár végén a lárvák a fészekben közösen kezdik a diapauzát, először észtiválnak, majd ősszel kezdik a hibernációt. Tavasszal megváltozik a lárvák életmódja: egyrészt szétszélednek és magányosan táplálkoznak; másrészt viszont tápnövényt váltanak, és különböző lágyszárú fajokat (pl. Plantago, Veronica, Melampyrum stb.) fogyasztanak (Wahlberg, 2000; Eliasson
& Shaw, 2003; Konvička et al., 2005; Freese et al., 2006; Dolek et al., 2012). A diapauza előtti lárvák életmódjából adódik, hogy a különböző kedvezőtlen környezeti hatások egyetlen fészeknek akár az összes lakóját érinthetik. Dolek et al. (2007) kimutatták, hogy a fiatal lárvák mortalitása rendkívül magas (átlagosan ~70%), ráadásul nagy a fészkek közötti variancia. Eredményeikből egyúttal az is következik, hogy számos fészekben az összes hernyó elpusztult. Vrabec & Jindra (1998) egy közép-csehországi habitatban azt figyelték meg, hogy a tüskés címerespoloska (Picromerus bidens) addig őrizte a megtalált hernyófészket, amíg az összes hernyót meg nem ette. De a kutatók azt is feljegyezték, hogy egy cserebogár faj (Melolontha sp.) egyik egyede a levelet a rajta lévő petecsomóval együtt fogyasztotta el (Wahlberg, 2001; Dolek et al., 2007). A lárvák a különböző parazitodok támadásának is együtt vannak kitéve a hernyófészekben. Dolek et al. (2007) például egy Cotesia faj nőstényét figyelték meg a petecsomó körül, aki rögtön belepetézett a kikelő kis lárvákba. A rossz időjárási viszonyok (pl. szeles, viharos idő) szintén együtt pusztítják el egy hernyófészek összes lakóját (McLaughlin et al., 2002). Ezeknek az intenzív
sztochasztikus hatásoknak a következtében az E. maturna populációkban jelentős mértékű a fluktuáció (Konvička et al., 2005): rossz években annyira lecsökkenhet az egyedszám, hogy a populáció a kihalás szélére sodródhat, míg szerencsésebb években az egyedszám megsokszorozódik. Ezek az intenzív sztochasztikus hatások nemcsak a genetikai sodródást, hanem a beltenyészetet is felerősítik a populációkban. Hiszen a hernyófészkeknek nemcsak a pusztulása, hanem a benne élő hernyók túlélése is közös. Így a populáció egyedszámának akár számottevő hányada is állhat csupán néhány nőstény túlélő utódaiból.
Célkitűzés
Munkánk célkitűzése az volt, hogy több generáción keresztül elemezzük egy E. maturna populáció finom genetikai struktúráját. A faj speciális szaporodási stratégiájából kiindulva azt vártuk, hogy a populációt alacsony effektív méret és relatíve magas beltenyészet jellemzi. Ezzel párhuzamosan arra számítottunk, hogy a kis effektív populációméret következtében intenzív lesz a genetikai sodródás, vagyis a generációk között viszonylag magas lesz a genetikai differenciálódás, illetve random változások jelennek meg egyes allélok frekvenciájában. Feltételezésünk szerint az alacsony effektív populációméret hátterében az áll, hogy a nőstények utódainak a túlélése között jelentős különbségek vannak.
Ebből adódóan bármely konkrét generációban a populáció számottevő hányadát olyan egyedek teszik ki, melyek egy anyától származnak, tehát teljes, vagy féltestvérek. Ezért a kutatás elsődleges célkitűzése az ilyen testvérek („családok”) keresése volt a díszes tarkalepke egyik nyírségi populációjában.
Céljaink megvalósítása érdekében mintákat vettünk a Fényi-erdő két szubpopulációjából.
A két mintavételi terület távolsága mintegy 3,5 km volt. A genetikai variabilitás szintjét az enzimpolimorfizmus vizsgálatával határoztuk meg, a mintákat 17 enzim lokuszon elemeztük.
E.1.2.1. ábra: A Fényi erdő két szubpopulációja. FO: Ömböly; FB: a román magyar határ melletti szubpopuláció (határszél).
Minták
Az E. maturna mintáit a Fényi erdő két szubpopulációjában (Ömböly és a román magyar határ) gyűjtöttük 4 egymást követő évben 2005, 2006, 2007 és 2008 (E.1.2.1. ábra, E.1.2.1.
függelék). A 4 Ömbölyi mintában összesen 173, míg a 4 határszéli mintában 128 egyed enzimpolimorfizmusát elemeztük.
Eredmények és értékelésük
A vizsgált E. maturna populáció viszonylag alacsony variabilitású volt, a 17 lokuszból négyen ugyanaz az allél fixálódott mind a 8 mintában. A 13 polimorf lokusz közül az egyedek átlagosan 2 lokuszon voltak heterozigóták (E.1.2.3. és E.1.2.4. táblázat: H).
Az effektív populációméret meglehetősen alacsonynak adódott, mindkét szubpopulációban Ne≈12 volt (E.1.2.1. táblázat). Az alacsony effektív populációméretnek megfelelően jelentős mértékű heterozigóta hiány mutatkozott a két szubpopulációban, az FIS
átlagos értéke 0,190 volt határszéliben (FB), míg 0,196 az ömbölyiben (FO). Ráadásul a heterozigóta hiány minden mintában (az FO szubpopuláció 2007-es mintája kivételével) következetesen szignifikáns volt (E.1.2.2. táblázat).
E.1.2.1. táblázat: A Nei és Tajima-féle temporális módszer alapján megállapított effektív populációméret (Ne) a két szubpopulációban. 95% CI: 95%-os konfidencia intervallum. FB: a magyar-román határon fekvő szubpopuláció; FO: Ömböly szubpopuláció. Gen.: generáció párok;
Totál: a generációpárok alapján megállapított értékek harmonikus átlaga.
Gen. FB FO
Ne 95% CI Ne 95% CI
1-2 10.0 4.6 20.9 19.8 6.9 86.3
1-3 15.9 3.9 53.3 12.5 2.9 49.4
1-4 8.8 2.9 21.2 17.5 5.6 52.4
2-3 26.0 10.2 86.0 6.0 0.9 31.5
2-4 12.6 4.3 36.2 13.0 1.5 130.0
3-4 13.4 4.9 53.3 18.9 5.4 Inf.
Totál 12.8 12.4
E.1.2.2. táblázat: A heterozigóta hiány mértéke a két szubpopuláció mintáiban. FIS: Wright-féle index; P: valószínűség. FB: a magyar-román határon fekvő szubpopuláció; FO: Ömböly szubpopuláció. Totál: a szubpopuláció összes mintájára megállapított FIS érték. A kritikus valószínűség a Bonferroni korrekció után 0.0038.
FB FO
FIS P FIS P
2005 0.271 0.0007 0.275 0.0007 2006 0.126 0.0028 0.135 0.0036 2007 0.164 0.0007 0.156 0.0153 2008 0.275 0.0014 0.197 0.0014 Totál 0.190 0.0003 0.196 0.0003
A populációk genetikai szerkezetének az elemzése azt mutatta, hogy a Fényi-erdő két szubpopulációjának a totális varianciája legnagyobb részben a szubpopulációk mintáin/
generációin belül figyelhető meg. A minták közötti varianciát pedig egyértelműen a szubpopulációkon belül, a minták/generációk közötti komponens határozta meg (E.1.2.2.
ábra). Az egyes évek/generációk mintái között tehát jelentős különbséget tapasztaltunk.
E.1.2.2. ábra: Az AMOVA eredménye az E. maturna két szubpopulációjában. BP: szubpopulációk közötti variancia komponens; BG: a szubpopulációkon belüli minták/generációk közötti variancia komponens; WG: a mintákon/generációkon belüli variancia komponens.
A továbbiakban azt vizsgáltuk meg, hogy milyen az egyes minták finom genetikai struktúrája, vagyis azt a hipotézist próbáltuk igazolni, hogy a minták számottevő hányadát néhány nőstény utódai alkotják. Ennek érdekében testvéreket/családokat kerestünk mind a 8 mintában. A testvérek keresését azzal kezdtük, hogy mindkét szubpopulációban megnéztük az allélgyakoriságok változását a 4 egymást követő generációban. Olyan allélokat kerestünk, melyeknek frekvenciája véletlenszerűen megnőtt egyik generációról a másikra.
Számos ilyen allélt találtunk elsősorban az Acon, Aox, Mdh, Me és a SodB lokuszokon.
Abból indultunk ki, hogy a kérdéses allél gyakoriságának a növekedését az okozhatta, hogy egy hordozó nősténynek több utódja élt túl, mint a populációs átlag. Így a következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy ezek az allélok milyen kombinációban fordulnak elő más lokuszok alléljeivel, és hogy az így talált specifikus allélkombinációk hány egyedre jellemzőek az egyes mintákban. Nagyszámban találtunk olyan allélkombinációkat, melyekben szerepelt valamelyik hirtelen megnőtt gyakoriságú allél. Ráadásul közülük számos allélkombináció több egyedben is jelen volt. Azt feltételeztük, hogy az ilyen specifikus allélkombinációkat közösen hordozó egyedek között vannak olyanok, amelyek egyetlen nősténytől származtak, tehát testvérek. Ez a megközelítés azonban nem adott lehetőséget a valódi testvérek kiszűrésére a specifikus allélkombinációt közösen hordozó egyedek közül.
Az analízis következő lépésében meghatároztuk az egyedek gamétafázisát az Excoffier–
Laval–Balding (ELB) algoritmus segítségével (Excoffier et al., 2003). Az analízisben a gamétafázis megállapítása iteratív módon történik, amelyben fontos szerepet játszik az egyes lokuszok közötti linkage. Mivel nem ismertük az enzim lokuszok közötti kapcsoltsági viszonyokat, ezért mind a 8 mintára 5 adat flile-t hoztunk létre, melyekben a lokuszok sorrendjét véletlenszerűen változtattuk meg. Így az analízis eredményeként minden egyedre 5 párhuzamos gamétafázist és azok valószínűségeit kaptuk meg. Az eredmények értékelése során először az 5 párhuzamos gamétafázis valószínűségét átlagoltuk minden egyedre
nézve, majd az egyedi átlagokból minta átlagot számoltunk. A mintákra jellemző átlagos valószínűségi értékek meglehetősen magasak voltak, a határszéli szubpopulációban (FB) 0,786, míg az ömbölyiben (FO) 0,784 (E.1.2.3. és E.1.2.4. táblázatok: P átl.). Azt is megállapítottuk, hogy mekkora azoknak az egyedeknek az aránya, amelyeknél az algoritmus által meghatározott gamétafázis megbízhatatlan, vagyis a valószínűsége alacsonyabb, mint 50%. Ez az arány a határszéli szubpopulációban (FB) 13,1%-nak, míg az ömbölyiben (FO) 15%-nak adódott (E.1.2.3. és E.1.2.4. táblázatok: %P<0,5). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az algoritmus segítségével megállapított gamétafázisok az egyedek többségénél megbízhatóak.
E.1.2.3. táblázat: A gamétafázis rekonstrukció eredményei a magyar-román határon fekvő szubpopulációban (FB). Totál: a minta összes egyedének átlaga; Sib: a feltételezett család egyedeinek átlaga; Sib átl.: a minta összes családjának átlaga; N/sib: a feltételezett családba tartozó egyedek száma; P átl.: a gamétafázis valószínűségének átlaga; %P<0.5: azoknak az egyedeknek az aránya, akiknél a gamétafázis valószínűsége 50%-nál alacsonyabb; H: az egyedek hetrozigóta lokuszainak átlagos száma.
N/sib P átl. %P<0.5 H
2005 Totál - 0.814 0.080 1.88
Sib FB5-A3 2 0.835 0 2.50
FB5-A5 2 0.863 0 2.00
FB5-G2 5 0.876 0 1.60
FB5-G3 3 0.908 0 1.67
Sib átl. 3.00 0.870 0 1.94
2006 Totál - 0.720 0.182 2.09
Sib FB6-A3 4 0.720 0 2.00
FB6-G1 4 0.927 0 1.50
FB6-G6 5 0.791 0 2.40
Sib átl. 4.67 0.813 0 1.97
2007 Totál - 0.791 0.086 1.95
Sib FB7-A6 4 0.794 0 1.75
FB7-A7 3 0.943 0 1.00
Sib átl. 3.50 0.869 0 1.38
2008 Totál - 0.819 0.176 1.95
Sib FB8-A2 3 0.921 0 1.67
Sib átl. 3.00 0.921 0 1.67
Totál
átl. - 0.786 0.131 1.97
Sib 10 3.50 0.868 0 1.74
Az elemzést azzal folytattuk, hogy kerestük azokat az azonos gamétafázisú allélkombinációkat (lényegében haplotípusokat), amelyek több egyedben is előfordultak. A továbbiakban ellenőriztük az ilyen, közös haplotípusokat hordozó egyedek gamétafázisát az 5 párhuzamos futásban. Csak azokat az egyedeket tekintettük valószínű testvéreknek, amelyeknél a kérdéses allélkombináció mind az öt futásban azonos gamétafázisban volt. A testvérek keresésének utolsó fázisában pedig összehasonlítottuk az így kiválasztott egyedek
gamétafázisának átlagos valószínűségét az adott minta átlagával. A végső szűrés után azokat az egyedeket fogadtuk el valószínű testvéreknek, amelyeknél az egyedi átlag magasabb volt, mint a mintaátlag.
E.1.2.4. táblázat: A gamétafázis rekonstrukció eredményei az Ömböly szubpopulációban (FO).
Totál: a minta összes egyedének átlaga; Sib: a feltételezett család egyedeinek átlaga; Sib átl.: a minta összes családjának átlaga; N/sib: a feltételezett családba tartozó egyedek száma; P átl.: a gamétafázis valószínűségének átlaga; %P<0.5: azoknak az egyedeknek az aránya, akiknél a gamétafázis valószínűsége 50%-nál alacsonyabb; H: az egyedek hetrozigóta lokuszainak átlagos száma.
N/sib P átl. %P<0.5 H
2005 Totál - 0.772 0.158 2.05
Sib FO5-G1 2 0.881 0 1.50
Sib átl. 2.00 0.881 0 1.50
2006 Totál - 0.782 0.116 2.30
Sib FO6-A3 3 0.976 0 1.33
FO6-G1 2 0.896 0 1.50
FO6-G2 3 0.890 0 2.00
Sib átl. 2.67 0.921 0 1.61
2007 Totál - 0.846 0.174 1.65
Sib FO7-N 3 0.970 0 1.00
FO7-A1 3 0.979 0 1.33
Sib átl. 3.00 0.974 0 1.17
2008 Totál - 0.734 0.150 2.25
Sib FO8-G3 2 1 0 1.00
Sib átl. 2.00 1.000 0 1.00
Totál átl. - 0.784 0.150 2.06
Sib 7 2.57 0.942 0 1.38
A szűrési folyamat eredményeként tíz lehetséges családot detektáltunk a határszéli (FB), míg hetet az ömbölyi (FO) szubpopulációban (E.1.2.3. és E.1.2.4. táblázat, valamint az E.1.2.2. és az E.1.2.3. függelék). A családok száma és mérete változatos volt a 8 mintában (E.1.2.3. és E.1.2.4. táblázat). A legtöbb családot a határszéli populáció 2005-ös mintájában találtuk, és egyúttal a legnépesebb családok is ebben a szubpopulációban jelentek meg (E.1.2.3. táblázat: FB5-G2 és FB6-G6). A családok átlagos mérete 3,46 volt a határszéli (FB) szubpopulációban, míg 2,57 az ömbölyiben (FO) (E.1.2.2. és E.1.2.3. függelék). Ez egyúttal azt is jelenti, hogy egy család átlagosan a minta 9%-át tette ki (E.1.2.2. és E.1.2.3.
függelék). A feltételezett családokra jellemző volt egy-egy ritka allél jelenléte, melyek közül néhány mindkét szubpopuláció családjaiban előfordult (pl. a Me1 az FB5-G2, FB6-G6, FB7-A7 és FB8-A2 valamint az FO6-G1 családokban) (E.1.2.4. ábra, valamint E.1.2.2. és E.1.2.3. függelék). Egyes családok azonban szubpopuláció specifikus ritka allélt hordoztak, mint az Mdh4 allél az FB6-A3 családban vagy a Lap2 allél az FO6-A3-ban (E.1.2.5. ábra, valamint E.1.2.2. és E.1.2.3. függelék). Néhány ritka allél esetében azt tapasztaltuk (pl. a Me1 allél a határszéli szubpopulációban), hogy több generációban is megjelennek olyan családok, amelyek hordozzák őket. Ezért összehasonlítottuk az ilyen családokban található haplotípusokat, és megállapítottuk, hogy különböző allélokat tartalmaztak a többi 12
polimorf lokuszon. Így feltételeztük, hogy ezek a családok egymástól függetlenül jelentek meg az egymást követő generációkban. Az azonos generációban talált családok haplotípusait összevetve azt a következtetést vontuk le, hogy az esetek többségében 2 család is származhatott egyetlen nősténytől. Ehhez csupán annak a feltételnek kellett teljesülnie, hogy a kérdéses nőstény 3 lokuszon volt heterozigóta, ami az egyedek 19%-ra igaz volt.
Ebben az esetben viszont egy nőstény utódai a mintának akár a 18-20%-t is kitehették.
Annak alátámasztására, hogy a feltételezett családok valóban egy szülőtől származó testvérek megállapítottuk az egyedek közötti rokonság mértékét. Azt vizsgáltuk, hogy a családok tagjainak rokonsági foka milyen mértékben tér el az egész mintára megállapított értéktől. Két módszert alkalmaztunk:
(a) minden mintán belül meghatároztuk az egyedpárok közötti rokonsági fokokat, majd külön-külön átlagoltuk azokat az egész mintára és az egyes családok tagjaira nézve;
(b) átlagos rokonsági fokot számoltunk az FSTAT program segítségével egyrészt az egész mintára, másrészt pedig a családokra.
Mindkét analízis eredménye azt mutatta, hogy a mintákon belüli átlagos rokonsági fok jelentősen alacsonyabb volt, mint az egyes családokon belüli érték (E.1.2.3. ábra). Mi több, a családokon belüli r értékek azt jelezték, hogy az egyedek teljes testvérek (r≥0,5).
E.1.2.3. ábra: A rokonsági fok mértéke az E. maturna két szubpopulációjának mintáiban. FB: a magyar-román határon fekvő szubpopuláció; FO: Ömböly szubpopuláció.
A és B: Az MLRELATE program segítségével meghatározott páronkénti rokonsági fokok átlaga. Av.
(sötét): a teljes minta átlaga; sib av. (szürke ): a feltételezett családok tagjainak átlaga.
C és D: Az FSTAT program segítségével meghatározott átlagos rokonsági fok. Tot (sötét): a szubpopuláció 4 mintájának átlaga; G05-G07 (FB) és a G06-G07 (FO) (világos szürke): a kérdéses évben megjelenő családok átlagos rokonsági foka; G av. (sötétebb szürke): A szubpopuláció összes feltételezett családjának az átlagos rokonsági foka.
Végül pedig azt vizsgáltuk, hogy egy adott generációban detektált családot jellemző allélkombináció milyen gyakorisággal volt jelen azonos gamétafázisban az előző, illetve a következő generációkban. Ha ugyanis munkahipotézisünk igaz, és a kérdéses haplotípust testvérek hordozzák, akkor annak frekvenciája abban a generációban nő meg (esetleg csak
abban a generációban jelenik meg) amikor magát a családot azonosítottuk. Ezért minden család esetében kerestük a rá jellemző haplotípust az összes többi generációban. Ebben az esetben is úgy jártunk el, mint a családok azonosításánál, vagyis a keresett allélkombinációt hordozó egyedet csak akkor fogadtuk el, mint haplotípust, ha mind az öt párhuzamos futásban azonos gamétafázisban hordozta a kérdéses allélkombinációt. Ezek után minden generációban meghatároztuk a családra jellemző haplotípust hordozó egyedek gyakoriságát.
A legtöbb esetben azt tapasztaltuk, hogy a családokra jellemző haplotípusok abban a generációban jelentek meg, vagy gyakoriságuk akkor nőtt meg jelentősen, amikor detektáltuk őket (E.1.2.4. és E.1.2.5. ábrák).
Eredményeinket összegezve megállapíthatjuk, hogy minden előzetes hipotézisünk helytállónak bizonyult.
a. Igazolódott az a feltevés, hogy a szubpopulációk effektív populációmérete alacsony, és jelentős mértékű bennük a beltenyészet.
b. Feltártuk, hogy a generációk közötti genetikai különbségek messze meghaladják a két szubpopuláció közötti differenciálódás nagyságát, ami erőteljes drift hatásra utal.
c. Minden mintában sikerült kimutatni, a családok (teljes testvérek) jelenlétét.
E.1.2.4. ábra: A Me1 ritka allélt hordozó feltételezett családok gyakorisága a két szubpopuláció 4 egymást követő generációjában. A fekete pontok a Me1 allél gyakoriságát mutatják. A szürke szimbólumok az egyes családok gyakoriságait jelzik.
A és B: A négy feltételezett család gyakorisága a magyar-román határon lévő szubpopulációban (FB).
C: A feltételezett család gyakorisága az Ömböly szubpopulációban (FO).
Ezt a három pontot összekapcsolva azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az E. maturna populációk méretének fluktuációja és a genetikai sodródás intenzív hatása a nőstények speciális reproduktív stratégiájára vezethető vissza. A hernyók közös táplálkozása és hibernációja azt eredményezi, hogy a lárvális túlélés varianciájának egy jelentős hányada nem az egyedek, hanem a hernyófészkek (családok) között jelentkezik (Vrabec & Jindra,
1998). Ebből adódik, hogy a következő generáció egyedeinek akár számottevő hányada is származhat néhány nősténytől, ami intenzív beltenyészetet okoz, és az egyedek között magas rokonsági fokot eredményez. Mindezek következményeként pedig alacsony lesz a populációk effektív mérete.
E.1.2.5. ábra: A család-specifikus ritka allélt hordozó feltételezett családok gyakorisága a két szubpopuláció 4 egymást követő generációjában. A fekete pontok a kérdéses család-specifikus allél gyakoriságát mutatják. A szürke szimbólumok az egyes családok gyakoriságait jelzik.
A: A Mdh4 allélt hordozó feltételezett család gyakorisága a magyar-román határon lévő szubpopulációban (FB).
B: Az Acon2 allélt hordozó feltételezett család gyakorisága az Ömböly szubpopulációban (FO).
C: A Lap2 allélt hordozó feltételezett család gyakorisága az Ömböly szubpopulációban (FO).