Feszültség-clamp méréstechnikák

A korábbi alfejezetek rámutattak, hogy a membránpotenciál-változás – így az akciós po-tenciál – hátterében a membrán ionáramainak megváltozása áll, ami az ioncsatornák ionos konduktanciájának változásával jellemezhető. Ennek megfelelően nagyon fontos a konduk-tanciák meghatározása. Ehhez olyan mérési összeállításra van szükség, amely segítségével a feszültség áramfüggése vagy az áram feszültségfüggése megadható.

Amikor feszültség áramfüggését vizsgáljuk, meghatározott nagyságú áramot injektá-lunk a sejt belsejébe (áramgenerátor vagy áram-rögzítés: current-clamp), és a hatására lét-rejövő feszültségváltozást mérjük (7.6.6. ábra). Ekkor a sejtbe helyezett elektróda (7.4.1. ábra) már nem csak a membránpotenciál változásának észlelésére kell, hogy alkal-mas legyen, hanem egyben áram injektálására is. A lokális áraminjekció következménye-ként azonban nem csak ionáram fog folyni a membránon, hanem jelentős kapacitív áram

is. Továbbá az alkalmazott áram nem csak a membránon keresztül, hanem oldalirányban is elfolyik.

Feszültség-rögzítés (feszültség-clamp) során a folyamat fordított (7.6.6. ábra). Adott feszültséget kényszerítünk a membránra, és a membránon átfolyó áramot mérjük. A szültség-rögzítés előnye, hogy a kezdeti rövid tranziens időintervallumtól eltekintve a fe-szültségnek időbeli változása nincsen, tehát a kapacitív áramkomponenstől eltekinthetünk (dUm/dt = 0), így az ionos konduktancia tisztán időfüggő változása mérhetővé válik.

7.8.1. Mérés mikroelektródákkal

A sejtmembrán áram–feszültség karakterisztikáját hagyományosan két, a sejttestbe vezetett mikroelektródával (7.8.1a. ábra) mérik, ahol az egyik elektróda az áram bevezetésére, míg a másik a membránfeszültség érzékelésére szolgál. A két szúró elektróda alkalmazásának azonban súlyos hátránya, hogy kicsi sejtek esetén túl nagy sérülést okoznak a membránon, ami a mérésben az Rm membránellenállással párhuzamosan megjelenő kis (néhány M) ellenállásként jelentkezik, jelentős – az áramelektródán kívül elfolyó – áram megindulását eredményezve az intra- és extracelluláris tér között.

A korszerű félvezető áramkörtechnika lehetővé teszi egyetlen mikroelektróda alkalma-zását és egyidejűleg a hozzávezetési ellenállás hatásának kiküszöbölését úgy, hogy az elektródát gyors, kiszajú elektronikus kapcsolóval felváltva hol a visszacsatoló erősítő áramkimenetére, hol pedig a feszültségkövető bemenetére kapcsoljuk (ún. mintavételezé-ses eljárás, 7.8.1b. ábra). A kapcsolgatás következtében feszültségméréskor csak az elha-nyagolható mérőáram folyik, így feszültségesés a mérőelektródán nem jelentkezik. A mód-szer azonban megkívánja, hogy a kapcsolgatás (azaz a mintavételezés) sebessége jóval nagyobb legyen a membránban keletkező áramváltozások sebességénél. Továbbá, az áram-ugrások következtében megjelenő rövid IC áramtüskéket szűrőáramkörrel el kell távolítani.

7.8.1. ábra: Feszültség-clamp mérés két (a), illetve egy (b) mikroelektródával

7.8.2. Mérés patch-clamp technikával

A sejt megsértése az ún. patch-clamp eljárással elkerülhető. A módszer bevezetése számos korábbi problémát kiküszöbölt, és rendkívül sokféle mérést tesz lehetővé nemcsak nagy, egész sejten, hanem kicsi sejten is, vagy akár kis membrándarabon (patch) – akár az egyedi ioncsatornák szintjén.

A patch-clamp eljárás alapja, hogy az elektródát nem a sejtbe szúrjuk, hanem szorosan a sejtmembrán felszínére illesztjük. Ehhez nem hegyes, hanem tompa végű üvegpipettát alkalmazunk, melynek „hőpolírozott” csúcsa a felillesztéshez tökéletesen sima felületet biztosít. Ha felillesztés után a pipettával a sejtfelszínre enyhe szívóhatást gyakorolunk, a membrán egy kis területen  alakban betüremkedik a pipettába úgy, hogy a terület szegé-lye szorosan a pipetta pereméhez tapad. Az illeszkedés elektromosan annyira jó, hogy a pipetta belső és külső tere között >1 G szigetelési ellenállás alakul ki, miközben a pipetta hozzávezetési ellenállása mindössze néhány (1–10) M. Vagyis a pipettán kívül elszivár-gó áram okozta mérési hiba <1% (szemben a mikroelektródával, ahol a szivárgási áram az elektródaáramnál nagyobb is lehet). A patch-pipettával kialakítható alapvető mérési össze-állítások a 7.8.2. ábrasorozaton láthatóak.

7.8.2. ábra: Patch-clamp technikák

„On-cell”. A patch-pipetta alatti kis membránfelületet vizsgáljuk úgy, hogy a potenciál-ját léptetjük és mérjük a rajta átfolyó áramot. A pipetta keresztmetszetből (~2 m) a spe-cifikus konduktancia számítható Ez a felület oly kicsi, hogy egyetlen csatorna nyílá-sa/záródása is jelentős áramváltozást okoz. Egyetlen ioncsatorna adott időpillanatban nyi-tott vagy zárt és az állapot-átmenet igen gyors, vagyis az áramváltozás ugrásszerű. Azonos típusú csatornák esetén az ugrások nagysága azonos, ennek alapján egyetlen csatorna ún.

elemi konduktanciája () kiszámítható. Az elemi konduktancia, a nyitott állapot hosszának

és az adott körülményekhez tartozó csatornanyitási valószínűség figyelembe vételével a különböző típusú ioncsatornák elkülöníthetők (7.8.3. ábra).

7.8.3. ábra: Egyedi, acetilkolin-vezérelt ioncsatornák patch-clamp regisztrátumai béka izomrost-ban – (a) egyetlen csatorna árama nyugalmi membránpotenciálon; (b) az elemi áramok

amplitúdó-eloszlása (egyetlen maximum egyféle aktív csatornatípus jelenlétére utal); (c) 3 aktív csatorna összárama (állandó  elemi konduktancia esetén U_m változásával az i elemi áram nagysága is

meg-változik).

„Inside-out”. Az illeszkedés mechanikailag olyan stabil, hogy húzásra a membrán el is szakítható anélkül, hogy a sejtről leszakadó darab a pipettáról leválna. Ekkor lehetséges a leválasztott membrándarab vizsgálata, amikor is a membrán sejt felőli oldala a pipettán kívül marad. Az egyedi ioncsatornák tetszőleges összetételű tesztoldatba merítve vizsgál-hatók.

Whole-cell”. A sejtmembrán egészén átfolyó áram mérése szolgál. Felhelyezés után a rögzített membrándarabot a pipettán keresztül hirtelen szívással átszakítjuk. Rövid idő alatt a pipetta-oldat és intracelluláris tér ionkoncentráció-különbségei kiegyenlítődnek és izopotenciális körülmények alakulnak ki.

„Perforated-patch”. Ez esetben nem mechanikai behatás, hanem csatornaképző anti-biotikum hoz létre elektromos összeköttetést. A nem permeábilis összetevők (pl. fehérjék) így nem diffundálnak el.

„Outside-out”. A membrán extracelluláris oldala marad a pipettán kívül és meríthető tesztoldatba. A membrán „megfordítása” úgy érhető el, hogy a membrándarabot a memb-rán átszúrása után húzzuk meg és szakítjuk le a sejtről. A leszakított membmemb-rán szegélye kiegészítő manipulátorokkal összeilleszthető, és megfelelő körülmények között a membrán (molekuláinak kötési tulajdonságainál fogva összeforr és összezáródik.