Felhasznált növényi anyag, nevelési körülmények és kísérleti elrendezések

Kísérleteinket Solanum lycopersicum Mill. L. cvar. Rio Fuego VT, valamint cvar. Ailsa Craig VT és homozigóta Nr/Nr, ET receptor mutáns növényeken végeztük, kétféle megközelítésben, de technikai okokból háromféle kísérleti elrendezésben (7. ábra). A paradicsommagokat három napon keresztül, sötétben, 26°C-on csíráztattuk, majd (1. és 3. elrendezés) kéthetes korukig perlitben, végül 6-7 hetes korukig (a 7 valódi leveles állapot eléréséig) folyadékkultúrában, üvegházi körülmények között neveltük. A 2. kísérleti elrendezés során a vegetatívan szaporított paradicsomnövényeket talajkultúrában, 2,5 kg kereskedelmi talajban (Bioland Tőzegfeldolgozó Kft., Biatorbágy, Magyarország), 25 cm átmérőjű cserepekben neveltük, A talaj N (200-500 mg L^-1), P2O5 (200-500 mg L^-1); K2O (300-600 mg L^-1), fehér tőzeg (50 m/v

%), fekete tőzeg (50 m/v %), és CaCO3 (2 kg m^-3) összetevőket tartalmazott és 5,5-ös pH értékkel rendelkezett. A kísérletekhez a háromleveles állapotú hajtásokat elvágtuk és 4 hétig gyökereztettük folyadékkultúrában.

38

A hidropóniában nevelt növények esetén az alábbi összetételű tápoldatot alkalmaztuk:

2 mM Ca (NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,5 mM KH2PO4, 0,5 mM Na2HPO4, 0,5 mM KCl és a mikroelemek (10^-6 M MnSO4, 5x10^-7 M ZnSO4, 10^-7 M CuSO4, 10^-7 M (NH4)6Mo7O24, 10^-5 M H3BO4), 2x10^-5 M Fe-EDTA, pH 5,8 [205], melyet kétnaponta cseréltünk. A növényeket 12/12 órás nappali/éjszakai fotoperiódusban, 300 µmol m^-2 s^-1 PPFD-n (F36W/GRO fénycsövek, Osram Sylvania, Danvers, MA, USA), 55-56%-os relatív páratartalmon (RH) és 25/22°C nappali/éjszakai hőmérsékleten neveltük. Vizsgálatainkat reggel 8 és délután 16 óra között végeztük, melyhez – ahogy a különböző kísérleti elrendezések esetében pontosan jelezzük – a gyökér teljes hosszát (főgyökér + oldalgyökerek + járulékos gyökerek), járulékos gyökerek teljes hosszát vagy 1 cm-es apikális régiójukat, illetve a hajtáscsúcstól számított a 3-4.

levélemeleten elhelyezkedő kifejlett, nem-szeneszcens leveleket használtuk fel. Az alkalmazott kísérletei elrendezések további részletei a következők:

1. elrendezés: A vizsgálataink első szakaszában, a gyökérzóna megemelt ACC tartalmának hatását vizsgáltuk egyéb, specifikus stresszfaktor alkalmazása nélkül, S.

lycopersicum Mill. L. cvar. Rio Fuego paradicsomfajta leveleiben és gyökereiben. Az előző alfejezetben leírt állapotú növények gyökérzónáját a vízkultúrában alkalmazott, a természetben is előforduló 0,01 µM-os és 1,0 µM-os, valamint a stressz ET mennyiségéhez hasonló ET-szintet generáló,100 µM-os ACC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kezelésnek tettük ki egy hetes intervallumban. Frissen feloldott ACC-t adtunk a tápoldathoz a cserék alkalmával is. A fotoszintetikus aktivitást naponta, a levelek és teljes gyökerek ET produkcióját az 1. 2. és 7.

napon, a növekedési paramétereket, a gyökércsúcsok-, valamint a levelek ROF és RNF tartalmát, a teljes gyökerek és levelek szénhidrát és elemtartalmát a 7. napon vizsgáltuk. A kísérletek mintavételi időpontjai 8-13 óra közé estek. Egy minta előállításához egy egyedi növény részeit használtuk fel, a mintaszámokat pedig az ábraaláírásokban, „n” jelöléssel adtuk meg. Ez alól kivételt képeztek a fluoreszcens mikroszkópiás mérések, ahol 4-4 növényből 16-16 szövet-szegmenst preparáltunk. Az összes kísérletet háromszor ismételtük.

2. elrendezés: Munkánk soron következő lépéseként kétféle erősségű sókezelés rövidtávú hatásait vizsgáltuk VT és Nr mutáns gyökerekben, S. lycopersicum Mill. L. cv.

Ailsa Craig genetikai háttérben. A hajtás gyökereztetése során kifejlődött, egyforma típusú, járulékos gyökereket hidropónikus kultúrában, a tápoldaton keresztül 100 mM-os – növekedésgátló, de tolerálható koncentrációjú, a továbbiakban „szubletális”, vagy 250 mM-os, néhány napon belül a növény pusztulását okozó, a továbbiakban „letális” koncentrációjú NaCl-dal kezeltük. A mintavételeket a kezelés megkezdését követő 1, 6, illetve 24 óra elteltével

39

végeztük el. Egy minta előállításához egy egyedi növény részeit használtuk fel, a mintaszámokat pedig az ábraaláírásokban, „n” jelöléssel adtuk meg. A kezeléseket délelőtt 9 órakor indítottuk el, továbbá legalább háromszor ismételtük meg független kísérletsorozatok formájában. A fehérje- és az elemtartalmak, illetve a proteolitikus aktivitás meghatározásához a járulékos gyökerek teljes hosszát; az elektrolit-kieresztés (EL) és a DNS fragmentáció vizsgálatához pedig a gyökércsúcsokat használtuk fel. A felsorolt kísérletekhez tartozó minták a kezelések 24 órás mintavételi időpontjából származtak. Ezen túlmenően, az ET produkció, a sejt életképesség, valamint a ROF és RNF akkumuláció monitorozását a gyökércsúcsokban végeztük az összes időpontban.

7. ábra Az alkalmazott kísérleti elrendezések

3. elrendezés: Kísérleteink harmadik szakaszában, a kétféle erősségű, rövidtávú sókezelésre adott válaszreakció és a növények ET státuszának kapcsolatát VT, VT és exogén ACC kezelt, valamint Nr mutáns S. lycopersicum Mill. L. cv. Ailsa Craig paradicsomfajta gyökereiben és leveleiben vizsgáltuk. Ennek megfelelően, a VT növények egy része a tápoldaton keresztül, 1 órás, 10 µM-os koncentrációjú – nem túl magas, de biztosan ET többletet generáló – ACC előkezelésben részesült, melyet a 100 mM-os, valamint 250 mM-os NaCl tápoldathoz adása követett, az ACC jelenlétének megtartása mellett. Ebben az időpontban, melyet a kísérlet kezdő, tehát 0. időpontjának tekintettünk, a VT növények fennmaradó része, továbbá a Nr mutánsok is részesültek az említett sókezelésekben. A mintavételeket a kezelés megkezdését követő 1, 6, illetve 24 óra elteltével végeztük el. Egy minta előállításához egy egyedi növény részeit használtuk fel, a mintaszámokat pedig az ábraaláírásokban, „n” jelöléssel adtuk meg. A sókezeléseket délelőtt 9 órakor indítottuk el, továbbá legalább háromszor ismételtük meg független kísérletsorozatok formájában. Az ET produkciónak, a friss és száraz tömegnek, az oldható cukor- és keményítőtartalomnak, a vizsgált antioxidáns enzimek aktivitásának és génexpressziójának a meghatározásához a gyökér teljes hosszát és a leveleket, a ROF és RNF akkumuláció monitorozásához a járulékos gyökerek

40

apikális szegmensét és a leveleket, a relatív víztartalom, a vízpotenciál és a fotoszintetikus aktivitás változásainak nyomon követéséhez pedig csak a leveleket használtuk fel az összes időpontban. A teljes gyökér és a levelek elemtartalmát, valamint a levelek pigmenttartalmát a 24 órás időpontban határoztuk meg.