GYULLADÁSBAN
Az sst4 receptor expressziója ép és gyulladt egértüdőben
Kvantitatív RT-PCR eredményeink azt mutatták, hogy az sst4 receptor mRNS jelen van az egértüdőben, de koncentrációja nem változott az endotoxinnal kiváltott szubakut gyulladás hatására (I/18. A. ábra). Western blot vizsgálataink bizonyították az sst4 receptor fehérjeszinten történő expresszióját is a tüdőben. A receptorprotein mennyisége azonban az mRNS-sel ellentétben jelentősen megnövekedett 24 órával az LPS intranazális adását követően. A kontroll fehérjeként szolgáló β-aktin mennyisége nem változott a gyulladás következtében (I/18. B.,C. ábra).
Ép tüdőben sst4 receptor immunpozitivitás volt látható a bronchiális/bronchioláris epithelsejteken, elsősorban a lumen felőli felszínen, a vaszkuláris bronchiális/bronchioláris simaizomsejteken, az erek endothelsejtjein és az alveolusok közti szeptumokban lévő kötőszöveti sejteken (I/19. A.,B. ábra). Gyulladt tüdőszövetben azonban 24 órával az intranazális LPS-kezelés után a megvastagodott epithelrétegben fokozódott az sst4 expresszió, valamint az erek és a bronchusok/bronchiolusok körül akkumulálódó mononukleáris sejtek (elsősorban makrofágok, de a limfociták is) és a neutrofil granulociták is jellegzetes sst4
immunpozitivitást mutattak (I/19. C.,D. ábra). Ezek az immunhisztokémiai adatok alátámasztják a western blot módszerrel nyert eredményeinket.
PBS LPS 0
1 2 3 4
Sst4 mRNS relatív expressziója
LPS LPS
sst470kDa β-actin 45kDa
PBS PBS
A.
C.
B.
0 50 100 150 200 250
PBS LPS sst4 receptor β-actin
*
Optikai denzitás egység
I/18. ábra. Sst4 receptor expresszió intakt és gyulladt egértüdőben. (A) Az sst4
receptor mRNS relatív expressziója 24 órával intranazális LPS-adás után, PBS-sel kezelt nem gyulladt tüdővel összehasonlítva. (B) Reprezentatív western blot minták az sst4 receptor fehérje homogenizált ép és gyulladt tüdőből történő meghatározására.
(C) A western blot minták denzitometriás vizsgálatának kvantitatív eredményei. Az oszlopok az A és C paneleken n=6 egér átlagát mutatják±SEM; *p<0.05 vs. PBS.
I/19. ábra. Szomatosztatin receptor immunlokalizációja egértüdőben. (A,B) intranazális PBS-sel kezelt egér tüdeje 200x-os és 400x-os nagyítással, (C,D) intranazális LPS-sel kezelt egér tüdeje 200x-os és 400x-os nagyítással (hematoxilin magfestés).
Az sst4 receptor expressziója ép és a gyulladt emberi tüdőben
A RT-PCR eredményeink alapján az sst4 receptor mRNS jelen van az ép emberi tüdőben, relatív expressziója 1.14±0.22, amely nagyon hasonló az egértüdőben mérthez.
Négy beteg esetében (1., 4., 5. és 6.) jelentős, 3.4-30.07-szeres emelkedést találtunk a gyulladt minták sst4 receptor mRNS expressziójában az azonos betegtől származó ép szövetrésszel összehasonlítva. E betegek jellegzetes klinikai tünetei és a gyulladt területek szövettani vizsgálata egyértelműen igazolták a krónikus bronchitis diagnózisát. Mind a négy beteg erős dohányos volt, a műtét két esetben kis perifériás primér adenokarcinóma miatt (4. és 6.), két esetben 2 cm-nél kisebb tüdőmetasztázis miatt (1.: hepatocelluláris karcinóma; 5.:
vesekarcinóma) történt. A krónikus gyulladást igazolta a kifejezett mononukleáris sejtes infiltráció (deszkvamáló interstíciális pneumonitisz). Az sst4 mRNS mennyisége a gyulladásos reakció súlyosságával egyértelmű korrelációt mutatott. Ezzel ellentétben, két betegnél (2. és 3.), ahol a szövettani diagnózis akut bronchopneumóniát igazolt, nem volt különbség az sst4 mRNS expresszióban a gyulladt és az ép minták között. Ezeket a betegeket kiterjedt, hilusra lokalizálódó laphámkarcinóma miatt operálták, amely az obstrukció következtében a perifériás területeken atelektáziát és akut gennyes bronchopneumóniát okozott. A gyulladt területen a neutrofil sejtek akkumulációja dominált (I/2. táblázat).
E tüdőminták immunhisztokémiai vizsgálatával nyert eredményeink azt mutatták, hogy az sst4
receptor ép emberi tüdőben a bronchioláris epithelsejteken, vaszkuláris endothelsejteken (I/20. B.,C. ábra), simaizomsejteken (I/21. A. ábra) és a szeptumban lévő fibrocitákon (I/20.
C. ábra) lokalizálódik nagyon hasonlóan az egérben tapasztaltakhoz (I/21. A.,D. ábra). Az I/22. ábra felső panele (B és C) az 1. számú beteg gyulladt tüdőmintájának sst4 receptor immunlokalizációját mutatja. Az ép résszel összehasonlítva (I/20. A.,D. ábra), nagyszámú sst4 pozitív aktivált makrofág és limfocita látható az alveolusokban a krónikus gyulladásos területen (I/21. B.,C. és I/22. D. ábra). Ez a morfológiai eredmény jól alátámasztja a markáns sst4 mRNS expresszió-növekedést a gyulladt mintában. A 2. számú beteg esetében bronchiektáziával társuló akut purulens bronchopneumónia volt a diagnózis, a bronchiolus lumenét teljesen kitöltik a szövettörmelékbe és nyákba ágyazott sst4 receptort nem expresszáló neutrofil granulociták, ezek mellett néhány sst4 immunpozitív limfocita is látható (I/21. E.,F. ábra), ami jól magyarázza a minimális sst4 mRNS növekedést.
I/20. ábra. Sst4 receptor immunpozitivitás az emberi tüdőben. Az sst4 receptor immunpozitivitás látható az (A) erek simaizomsejtjein, (B) a bronchusok/bronchiolusok epithelsejtjein, (C) az erek endothelsejtjein, a szeptumokban lévő fibrocitákon, valamint (D) krónikus gyulladás esetén az intraalveoláris területeken akkumulálódó aktivált makrofágokon és limfocitákon (deszkvamáló intraalveoláris pneumonitisz, respiratórikus bronchiolitisz) (400x-os nagyítás, hematoxilin magfestés).
Az sst4 receptor mRNS expressziója a
18S riboszómális mRNS-re normalizálva Beteg Gyulladás típusa:
hisztopatológiai jellemzők
Ép terület Gyulladt terület fibrózis, a makrofágokban és az interstíciális területeken is fekete granuláris pigmentdepozitumok,
3 Akut bronchopneumonia interstíciális ödémával és jelentős neutrofil sejtes infiltrációval
I/2. táblázat. Az sst4 receptor mRNS relatív expressziója emberi tüdőmintákban
I/21. ábra. Az sst4 receptor immunhisztokémiai vizsgálata (A,D) ép és (B,C,E,F) gyulladt emberi tüdőmintákban. A baloldali panelek az 1. számú betegből (krónikus bronchitisz), a jobboldaliak a 2. számú betegből (akut obstruktív purulens bronchopneumónia, bronchiektázia) származnak (A,B,D,E: 200x; C,F: 400x-os nagyítás, hematoxilin magfestés).
AZ SST4 RECEPTOR SZEREPE ENDOTOXINNAL KIVÁLTOTT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN EGÉRBEN
Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás sst4+/+ és sst4-/- egerekben
A carbachol-inhaláció mindkét csoportban koncentrációfüggő bronchokonstrikciót okozott, a PBS-kezelt sst4+/+ és sst4-/- állatok válaszai között nem volt jelentős különbség. LPS-sel kiváltott gyulladásban azonban az sst4-/- egerek maximális Penh értékei nagyobbak voltak és a bronchokonstrikció időtartama hosszabb volt a receptor génhiányos csoportban (I/22. ábra).
100 200 300 400 500 600 700 800
*
*
Átlag Penh %-os változása
sst4+/+, PBS sst4-/-, PBS sst4+/+, LPS sst4-/-, LPS
5.5 11 22
Carbachol koncentráció (mM)
*
I/22. ábra. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás sst4+/+ és sst4
-/-egerekben (átlag±SEM; *p<0.05 vs. sst4+/+).
Gyulladásos változások, MPO-aktivitás és citokin-koncentrációk sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében
A szövettani vizsgálatok és a szemikvantitatív értékelés azt mutatták, hogy az LPS hatására az sst4-/- egerek tüdejében jelentősen súlyosabb gyulladás alakult ki, mint a vad típusúakban:
kifejezettebb peribronchiális/perivaszkuláris ödéma, a bronchusok, bronchiolusok körül fokozottabb granulocita-felhalmozódás, intenzívebb mononukleáris sejtes infiltráció és goblet sejt hiperplázia volt megfigyelhető (I/23. ábra).
Az LPS-kezelés mindkét csoportban többszörösére emelte a gyulladt szövetben felhalmozódott granulociták mennyiségét jelző MPO-aktivitást, valamint az IL-1β és TNF-α mennyiségét a megfelelő PBS-kezelt kontrolljaikhoz hasonlítva. Ez az emelkedés mindhárom paraméter esetében szignifikánsan nagyobb volt az sst4-/- csoportban, mint a vad típusú egerekben (I/24., I/25. ábra).
b
I/23. ábra. LPS-sel kiváltott gyulladásos változások sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében. (A) intranazális PBS-sel és (C) LPS-sel kezelt sst4+/+, valamint (D) LPS-kezelt sst4-/- egér tüdejének metszete (PAS festés, 200x-os nagyítás; [a]: alveolus, [b]:
bronchiolus, [v]: ér, [öd]: ödéma. (B) Szemikvantitatív szövettani értékelés pontszámai (statisztikai középértékek±25-75 percentilis; +p<0.01 vs. PBS; *p<0.05 vs. sst4+/+).
0
I. 4. 4. Fejezet: SST4 RECEPTOR AGONISTA VEGYÜLETEK HATÁSA