4. P ROTEOMIKA
4.4. Gabona allergén fehérjéinek proteomikai analízise
4.4.2. Emelt dózisú gombaölő szer hatása tritikále magjának fehérje-összetételére 103
A vizsgálatokban felhasznált Bogo fantázianevű tritikále a Gabonatermesztési Kutató Kht. (Szeged) telepéről származott. A szabadtéri növényeket először az aratás előtt 51 nappal (virágzás idején) 0,6 L/ha propikonazollal, majd 43 nappal (kalászolás idején) 1,5 L/ha emelt dózisú tebukonazollal permetezték. A tebukonazol a propikonazolhoz hasonlóan a triazolok csoportjába tartozó fungicid szer, mely a penészgombák fő sejtfal alkotó komponensének, az ergoszterolnak a bioszintézisét gátolja. A kontroll (BO) és a permetezett (BK) minták feldolgozása és analízise az előző kísérletnél leírt módszerekhez hasonlóan történt [249].
Eredmények és megbeszélésük
A tritikále minták albumin-globulin frakcióját 2D-PAGE-val (pI 5,0-8,0 és 5-120 kDa) választottuk el (55. ábra), mert előkísérletekben ebben az izoelektromospont-tartományban detektáltuk a legtöbb változást.
55. ábra
Kezeletlen (A) és emelt dózisú fungicidekkel kezelt (B) Bogo tritikále albumin-globulin frakcióinak 2 DE képe (a számozott foltok az azonosításra kivett fehérjéket jelölik) IEF: 17 cm pH 5-8 lineáris IPG csík, PAGE: 16 x 16 cm 12% poliakrilamid gél, festés CBB R-250
A kontrol és emelt dózisú fungiciddel kezelt minták között jelentős fehérjeexpresszió-különbséget találtunk. A legnagyobb eltéréseket mutató foltokból tripszines hidrolízis után MALDI-TOF tömegspektrométeren „peptid tömeg térképezés”-sel azonosítottuk a fehérjéket
(8. táblázat). Az emelt dózisú fungiciddel történt kezelés hatására beindult védekezési mechanizmus hatására az előző fejezetben megismert kiterjedt α-amiláz inhibitor-család néhány tagjának megváltozott expresszióját itt is kimutattuk. Ezen fehérjék patogének elleni védelmi funkciójáról és allergén jellegéről többen is beszámoltak [250, 251]. A fungicid elleni védekezésben megjelent két endogén α-amiláz/szubtilizin inhibitort is, melyek eredetileg a mikrobiális eredetű proteázokat gátolják. Sikerült kimutatnunk egy penész rezisztencia fehérjét is (AAT39944). Két foltban is növekedett az expressziója ugyanannak a proteinázgátló fehérjének (20798981). Az eredményekből látszik, hogy a különböző stresszorok (szárazság, herbicid) részben hasonló válaszokat váltottak ki, ami azt jelenti, hogy ezek a fehérjék a növények általános védelmi rendszerének tagjai.
8. táblázat
Bogo tritikáléban emelt dózisú fungicidekkel történő kezelés hatására megváltozott expressziójú fehérjék adatai
Minta Azonosító Fehérje Faj
Molekula-tömeg (Da)
pI Szekvencia-lefedettség
BO/3 100769 alfa-amiláz inhibitor Triticum
aestivum 13056,2 5.38 42%
BO/4 56480630 0,19 dimer alfa-amiláz
inhibitor Triticum
aestivum 13191,3 5.23 24%
BK/1 65993781 dimer alfa-amiláz inhibitor Triticum
aestivum 15046,4 5.59 31%
BK/3 54778503 0,19 dimer alfa-amiláz
inhibitor Triticum
aestivum 13256,4 5.73 24%
BK/6 123975 Endogén α-amiláz/
szubtilizin inhibitor (WASI Triticum
aestivum 19633,1 6.77 17%
BK/7 123975 Endogén α-amiláz/
szubtilizin inhibitor (WASI) Triticum
aestivum 19633,1 6.77 41%
BK/12 AAT39944 Feltételezett fitoftóra-
rezisztencia fehérje Solanum
demissum 14652,4 5,7 6,3%
BK/17 P16347 Endogén α-amiláz/
szubtilizin inhibitor (WASI)
Triticum
aestivum 19848,9 6,9 38%
BK/18 P16347 Endogén α-amiláz/
szubtilizin inhibitor (WASI) Triticum
aestivum 19848,9 6,9 68%
BK/4 20798981 WCI proteináz inhibitor Triticum
aestivum 12944,1 7,42 16%
BK/5 20798981 WCI proteináz inhibitor Triticum
aestivum 12944,1 7,42 16%
Gabonaallergiás szérummal végzett immunblot-tal az azonosított fehérjék közül a BO/4 jelű dimer α-amiláz inhibitor, a BK/1 jelű dimer α-amiláz inhibitor és a BK/17 jelű endogén α-amiláz/szubtilizin inhibitor adott pozitív reakciót, ami megerősíti azokat az irodalmi adatokat, melyek szerint a növényi védekező rendszer fehérjéinek nagy többsége ismert allergén fehérje.
4.4.3. Magyarországi gabonafajták és pszeudocereáliák allergén fehérjéinek vizsgálata Az élelmiszer-biztonsággal kapcsolatos módszertani fejlesztések között kiemelt szerepet kapott a táplálék allergének kimutatása és mennyiségi meghatározása. A rutin diagnosztikában az allergének élelmiszerekből történő kimutatása leggyakrabban immunológiai módszereket alkalmaznak [240, 252], de az új proteomikai technikák is egyre inkább terjednek [253].
Kísérletek
A vizsgálatban felhasznált gabona minták (búza (Triticum aestivum), GK Tisza, 2004, Triticum. spelta, ÖKO-10, 2004, Triticum durum, D-78, 2004, (Triticum aestivum), GK Cipó, 2004, (Triticum aestivum), CY-45 Grandstar, 2001, rozs (Secale cereale), Amilo, 2004, Tritikálé (Triticosecale sp.), tavaszi, EMBR 18, 2004, árpa (Hordeum vulgare), tavaszi, STC I. 22-03, 2004 és csupasz zab (Avena nuda), tavaszi, GK Zalán, 2004) és pszeudocereália minták (amaránt (Amaranthus cruentus), GK Maros, 2005, hajdina (Fagopyrum esculentum), 430 törzs, 2003, kukorica (Zea mays), Ella SC, 2004 és rizs (Oryza sativa), Bioryza, 2003) a Gabonatermesztési Kutató Kht.-tól (Szeged) származnak.
A magvak albumin/globulin frakcióját 50 mM Trisz-HCl pufferrel (pH 8,5) extraháltuk, az alkohol oldható frakciót 70% etanollal nyertük. Fehérjék elválasztása SDS-PAGE-val 15%-os poliakrilamid gélen történt. Immunblottolás után az allergén fehérjék kimutatása klinikailag igazolt gabona-allergiás (IgE mediált) és cöliákiás (IgA mediált) betegek szérumával történt.
Fehérjeazonosítás a gélcsíkok kivágása, redukálása, alkilezése és tripszines hidrolízise után LC-MS/MS módszerrel történt. Az elválasztást 0,075 x 150 mm-es Zorbax 300SB-C18, 3,5 µm oszlopon, az analízis pedig Agilent XCT ioncsapdás tömegspektrométerrel végeztük. Az MS/MS adatok kiértékelésére SpectrumMill szoftvert és az aktuális Uniprot-trEMBL adatbázist használtuk.
Eredmények és megbeszélésük
Vizsgálatainkat hazai búza allergének és a velük keresztreagáló gabonafehérjék vizsgálatára fókuszáltuk. A búzán kívül olyan gabonákat, illetve pszeudocereáliákat is vizsgáltunk, amelyek a búzával együtt szintén a cöliákia kiváltói (búzával keresztreagálók:
tritikálé, rozs, árpa, zab) lehetnek, illetve amelyek nem okoznak klinikai tüneteket a cöliákiás betegekben (búzával nem-keresztreagálók: amaránt, hajdina, kukorica, rizs). Minden vizsgálatba vont hazai gabonában, illetve pszeudocereáliában nemcsak a cöliákiás, hanem a
gabonaallergiás betegekben potenciálisan klinikai tüneteket kiváltó fehérjéket is monitoroztuk.
A vizsgált öt búzafajta víz/só-oldható frakciójának (1, 2, 3, 4, 5), ill. ioncserés kromatográfiával dúsított két frakciójának (1’, 1”, 2’, 2”, 3’, 3”, 4’, 4”, 5’,5”) (58. ábra A), ill.
alkohololdható glutén frakciójának SDS-PAGE képét mutatja be 56. ábra (B). Ugyanezen az ábrán látható a víz/só-oldható és alkohol-oldható frakcióinak immunblotja cöliákiás, ill.
alkohololdható frakciójának immunblotja gabonaallergiás betegek szérumával reagáltatva.
Ioncserés dúsítás hatására láthatóvá váltak (eltérő mértékben) a víz/só-oldható frakciók IgE antitestekkel (gabona-allergiás beteg széruma) reagáló allergén fehérjéi, melyek minden minta esetében a 10-16 kDa, 31- 37, 45-70 kDa molekulatömeg-tartományba helyezkedtek el.
56. ábra
Magyar búzafajták víz/só (A), ill. alkohol-oldható (B) frakcióinak SDS-PAGE képe, valamint cöliákiás (C, D), ill. gabona-allergiás betegek szérumával (E) készült immunoblotjai
Mt, 1: T. aestivum, GK Tisza, 2004, 2: T. spelta, ÖKO-10, 2004, 3: T. durum, D-78, 2004, 4: T. aestivum, GK Cipó, 2004, 5: T. aestivum, CY-45 Grandstar
Mt 1 2 3 4 5
B
Mt 1 2 3 4 5 Mt 1 1’ 1” 2 2’ 2” 3 3’ 3” 4 4’ 4” 5 5’ 5” D
A
Mt 1 1’ 1” 2 2’ 2” 3 3’ 3” 4 4’ 4” 5 5’ 5”
C
Mt 1 1’ 1” 2 2’ 2” 3 3’ 3” 4 4’ 4” 5 5’ 5”
E
A különböző búzafajták alkohololdható fehérjefrakcióinak cöliákiás humán szérummal szemben IgA-reaktívnak bizonyuló fehérjéi majdnem mindegyik fajtában egyformán 37-54 kDa sávban helyezkedtek el. A többi gabona és pszeudoceriália víz/só- és alkohololdató frakcióinak vizsgálatakor az albumin/globulin frakcióban erősebb IgE pozitivitást találtunk a gabonáknál, míg jóval kisebbet a pszeudocereliák esetén. A zab és a kukorica alkoholos extraktuma is mutatott IgE-reakciót. A rizs víz/só-oldható frakciója tartalmazott a legkevesebb IgA-pozitív allergént, de meglepő, hogy a cöliákiás diétából nem kizárt amaránt és hajdina fehérjék IgA-reaktivitást mutattak. Az alkohololdható frakciók közül az amarant, hajdina és a rizs volt mentes cöliákiás tüneteket okozó allergénektől.
Proteomikai fehérjeazonosításra a búzák közül a T. aestivum, GK Cipó, 2004 mintát választottuk, mert ez minden olyan molekulatömeg-tartományban tartalmazott gabonaallergiás humán szérumokkal szemben IgE-reaktív fehérje csoportokat, melyek más búzafajtáknál is felismerésre kerültek. A búzával keresztreagáló és nem-keresztreagáló gabonák/pszeudocereáliák extraktumaiból 1-1 nagyon gyakori és intenzív sáv került azonosításra. A fehérjéket szigorú kritériumok alapján, az LC-MS/MS mérések eredményeinek nrNCBI Plant adatbázisban végrehajtott keresése alapján azonosítottuk (Függelék, 6. táblázat). Búzában a már korábban is megtalált α-amiláz inhibitor családon túl (monomer, dimer, CM2, CM3, CM16, CM17 fehérje prekurzor) ismert allergén fehérjéket [241], mint xilanáz inhibitorokat, szerpineket (Z1A, Z1C, Z2A, Z2B), ns-LTP prekurzort, HMW glutenint és avenint találtunk. A pszeudocereáliák közül az amarantban agglutinint, hajdinában 13S globulint (magi tároló protein 2, 3), kukoricában leginkább enzimeket (endokitináz A, B) azonosítottunk, melyek nem voltak ismert allergének, míg a rizsben az allergén cupin szupercsalád tagját azonosítottuk. A búzával rokon rozsban az ismert allergén szerpinen kívül béta-amilázt, az árpában Hsp70-t, a zabban különféle enzimeket (alfa-1,4-glükán-protein szintáz, aszpartát aminotranszferáz, fruktóz-biszfoszfát aldoláz, GAPDH) azonosítottunk.
Az eredmények azt mutatják, hogy az idők folyamán a búza sok fehérjéje vált allergénné, alakult ki ellene IgE, ill. IgA antitest, melyek atópiás személyekben allergiás reakciókat válthatnak ki. Az emberi táplálkozásban sokkal kisebb szerepet játszó egyéb gabonafélék is tartalmaznak a búzáéhoz hasonló ismert allergéneket (pl. szerpin), azonban jóval kisebb mennyiségben. Eddig nem volt ismert, hogy a pszeudocereáliák víz/só frakciója is tartalmaz IgA-aktív fehérjéket, azonban ezek nem glutén (gliadin + glutenin) eredetűek.