A mitokondrium esszenciális jellegének igazolása

A mitokondrium nélkülözhetetlen organelluma az eukarióta sejteknek. Anabolikus és katabolikus reakciók egész sorának végrehajtásában játszik fontos szerepet: a citrátkör és a terminális oxidáció mellett itt zajlik például a zsírsavak béta-oxidációja, az urea ciklus, aminosav bioszintézis, valamint a hem szintézis néhány lépése, ezen kívül fontos szerepe van jelátviteli folyamatokban és az apoptózis szabályozásában is [275]. Érdekes módon ezen funkciók egyike sem esszenciális: a légzési lánc, az ATP termelés, avagy a számos bioszintetikus reakció elvesztését követően pl. az élesztő sejtek megfelelő környezetben képesek tovább élni [276]. A legelső és a sokáig egyetlen ismert és nélkülözhetetlen mitokondriális funkció a vas-kén fehérjék aktivációjához szükséges vas-kén komplex bioszintézise [277]. Az azonban nem volt ismert, hogy miért teszi ez a funkciója a mitokondriumot az eukarióta sejtek elengedhetetlen alkotórészévé. Úgy gondoltuk, hogy a mitokondrium egy vagy több pótolhatatlan funkciót betöltő extramitokondriális vas-kén fehérje aktivációjával válik létfontosságú sejtalkotóvá.

Kutatásainkhoz tehát egy olyan élesztő (Saccharomyces cerevisiae) célfehérjét kerestünk, amely valószínűleg vas-kén fehérje, az élesztőben bizonyítottan esszenciális, de alapvető szerepe még nem tisztázott. A fehérje adatbankok átvizsgálása után az addig ismeretlen funkciójú Rli1p-re esett a választásunk. Ez a fehérje egyike az evolúció során legerősebben konzerválódott fehérjéknek, látszólag minden archeában és eukariótában megtalálható.

Együttműködő partnereim bebizonyították, hogy az Rli1p prosztetikus csoportként vas-kén komplexet köt, viszont ellentétben a többi ismert esszenciális vas-kén fehérjével, nincs szerepe a vas-kén komplex bioszintézisében. Így ez a fehérje, funkciójának feltárásán keresztül megfelelő jelölt lett annak a kérdésnek a megválaszolására, hogy miért nélkülözhetetlen a mitokondrium az eukarióta sejtek számára.

Az Rli1p funkciójának megértéséhez elengedhetetlenül fontos megvizsgálni, milyen további fehérjékkel kapcsolódik a sejten belül. A lehetséges kötő partnerek izolálására affinitáskromatográfiát, azonosításukra proteomikai módszereket alkalmaztunk.

Kísérletek

A Rli1p-hez kötődő fehérjék kinyerésére a kofrakcionálás egyik formáját, a TAP-tag (Tandem Affinity Purification) affinitás kromatográfiás módszert alkalmaztuk, amely egy általánosan használt eljárás TAP-tag-gel ellátott fehérjék és az általuk képzett komplexek natív körülmények közötti hatékony és nagy tisztaságú izolálására [278]. A TAP-tag két

proteáz hasítóhelye választ el egymástól. A kísérlethez egy olyan törzset hoztunk létre, amelyben az RLI1 génjéhez TAP-tag-et kapcsoltunk, miközben a gén továbbra is saját endogén promóterének szabályozása alatt állt (RLI1-TAP törzs). A kétlépéses affinitás kromatográfiás módszer során az élesztősejt extraktumát először IgG-affinitás oszlop, majd DMV proteáz hasítást követően kalmodulin-affinitás oszlop használatával tisztítottuk. Az Rli1-TAP fehérjét és a hozzá kötődő fehérjéket ezután SDS-PAGE segítségével szétválasztottuk. A legnagyobb mennyiségben jelenlévő fehérjéket gélben történt emésztés után MALDI-TOF tömegspektrométeren végzett „peptid tömeg térképezés” módszerével, az MS-Fit szoftverrel (UCSF; http://prospector.ucsf.edu/) nrNCBI adatbázisban történt kereséssel azonosítottuk. Az MS spektrumban legintenzívebb két csúcsot adó peptidjének szekvenciáját PSD MS/MS segítségével határoztuk meg.

Eredmények és megbeszélésük

A TAP-tag affinitás kromatográfia óriási előnye más izoláló módszerekkel szemben egyrészt a kétlépéses tisztítás, amellyel még specifikusabb és megbízhatóbb módon tisztíthatók a TAP-tag-et hordozó fehérjék kötő partnerei, valamint a natív viszonyokat imitáló körülmények, amelyek lehetővé teszik, hogy az in vivo asszociációk a tisztítási lépések folyamán megmaradjanak. Az SDS-PAGE elektroferogramon látható, hogy az TAP-tag-s tisztítás első lépésében még sok, kisebb affinitással kötődő fehérje eltávolítása jóval tisztábbá teszi a képet (59. ábra).

59. ábra

Rli1p-vel kölcsönható fehérjék TAP-tag affinitáskromatográfiás tisztításának elektroferogramja, ill. a proteomikai módszerrel azonosított fehérjék elhelyezkedése

SDS-PAGE 12% gél, festés CBB R-250

Az Rli1p-n kívül csak riboszómális fehérjéket, a kis (40S) és nagy (S60) alegységek alkotóit mutattunk ki (nagy találati pontszámmal: Mowse pont) (12. Táblázat), ami azt jelenti, hogy a Rli1p a 80S citoszólikus riboszómához kötődik.

12. Táblázat

Rli1p-vel kölcsönható fehérjék MALDI-TOF tömegspektrometriás azonosításának eredményei

Fehérje neve Azonosító # Molekulatömeg Lefedettség % Mowse pont

Rpl1p NP_010376 68341 41 1,303e+008

Rpl3p NP_014706 43758 45 2,331e+006

Rpl4ap NP_009587 39092 52 1,241e+006

Rpl4bp NP_010295 39062 52 7,992e+005

Rpl2bp AAA34974 39125 40 4,899e+004

Rpl10p NP_013444 33718 38 3,216e+005

Rps1bp NP_013648 28813 53 7,260e+005

Rps1ap NP_013546 28744 48 2,192e+005

Rps4bp NP_012073 29410 44 2,029e+004

Rps4ap NP_012679 29410 44 2,029e+004

Rpl8bp NP_013055 28112 38 1,0e+000^*

Rpl7ap NP_011439 27638 63 6,065e+005

Rpl7bp NP_015126 27697 59 2,296e+005

Rpl16ap NP_012133 22201 26 3,6e-001^*

Rps8ap NP_009481 22490 42 2406

Rps8bp NP_011028 22490 42 2406

Rpl13bp NP_013862 22525 40 2039

Rpl13ap NP_010201 22554 40 2036

Rps17ap NP_013688 15788 43 5,0e-001^*

Rps16bp NP_010200 15847 34 3,2e-001^*

Rps24ap NP_010997 15329 39 3,2e-001^*

Az eredmények igazolására a kísérletben használt törzs sejtextraktumát cukorgradiens ultracentrifugálással elválasztották és az egyes frakciókat Western blot-tal vizsgálták Rli1p-TAP, Rps3p, Rpl10p fehérjékre. A kísérlet eredménye megerősítette eddigi megfigyeléseinket, hogy bár az Rli1p legnagyobb része a kis riboszómális alegységhez kötődik, a fehérje mindkét alegységgel, valamint a kész 80S riboszómával is képes kapcsolódni.

Az itt ismertett, a Rli1p-vel kölcsönható fehérjék azonosítása része volt egy nagyobb, az Rli1p tulajdonságait kutató kísérletsorozatnak. Vizsgálataink során bebizonyítottuk, hogy az élesztő Rli1 fehérje alapvető szerepet játszik a riboszómák érésében. Mindez a mitokondrium esszenciális jellegét is megmagyarázza, hiszen ez az organellum a vas-kén komplex szintézise által egy olyan vas-kén fehérjét aktivál, amely a riboszómák érésének elősegítésén keresztül elengedhetetlen a fehérjeszintézishez.