G.
Kr a m p i t zINSTITUT FÜ R ANATOMIE UND PHYSIOLOGIE DER HAUSTIERE, UNIVERSITÄT, BONN
Z usam m enfassung
E s w ird d a s P rin z ip d e r c h ro m a to g ra p h is c h e n B e s tim m u n g v o n A m in o s ä u r e n sow ie e in e A p p a r a tu r z u r D u rc h fü h ru n g d e r B e s tim m u n g b e sc h rie b e n . D ie q u a n tita tiv e B estim m u n g von A m inosäuren h a t fü r die U n te r su chung von P ro tein en u n d P e p tid e n e tw a die gleiche B ed eu tu n g wie die E le m e n ta ra n a ly se fü r einfache chem ische V erbindungen.
An d e r B estim m u n g von A m inosäuren is t n ic h t n u r d e r P ro tein ch e m ik er, so n d e rn au ch d e r M ediziner in tere ssie rt. D e r M ediziner m öchte sieh v o r allem ü b e r die G ehalte an einzelnen A m inosäuren in den K ö rp e rp ro tein e n sowie in d e n K örperflüssigkeiten u n d n ic h t z u le tz t ü b e r die q u a lita tiv e u n d q u a n tita tiv e Z usam m ensetzung d e r S am enflüssigkeit an E iw eiß b au stein en inform ieren.
Im L aufe des le tz te n J a h rz e h n te s sin d viele erfolgreiche V ersuche u n te rn o m m en w orden, u m die B estim m u n g von A m inosäuren im biologischen M ateria l m ö glichst genau, sicher u n d einfach zu g estalten . Von allen bislang b esc h rie
benen V erfah ren h ab e n die chrom ato g rap h isch en M ethoden n ac h Mo o r e u n d St e i n die g e n a n n te n F o rd e ru n g e n am ehesten e rfü llt [2, 3, 4].
D as P rinzip des V erfahrens b e ste h t d a rin , d aß p ra k tis c h alle A m in o sä u re n an einem sau ren K a tio n e n a u sta u sc h e rh a rz ad so rb ie rt u n d an schließend m it P ufferlösungen von steigendem p H -W e rt e lu ie rt w erden. D ie aus den g e n a n n te n H arzsäu len a u s tre te n d e n A m inosäure-Z onen können en tw ed er m it H ilfe eines F rak tio n ssam m le rs portionsw eise aufgefangen o der m itte ls einer von u ns b e n u tz te n a u to m atisch en A p p a ra tu r q u a n tita tiv b e stim m t w erden.
D ab ei w ird in das E lu a t k o n tin u ie rlich eine N in h y d rin lö su n g ein g esp ritz t u n d das G em isch von E lu a t u n d N in h y d rin lö su n g d u rc h lä u ft eine a u f 100° C e rh itz te T eflonspirale; d o rt en tw ick e lt sich die ty p isch e b lau -v io le tt-F ä rb u n g bei A nw esenheit von n in h y d rin -p o sitiv e n S ubstanzen. D ie F ä rb u n g w ird d a n a ch fo rtla u fe n d p h o to m e trisc h gem essen u n d re g is trie rt.
Im folgenden sollen die einzelnen B au elem en te u n d ih re W irkungsw eise e r lä u te r t w erden.
1. Austauschersäule
In d e r A p p a ra tu r sin d 3 S äu len ty p en von jeweils 0,9 cm inn erem D u rc h m esser ein g eb a u t, die m it A u stau sch ern vom T y p A m b erlite I R 120 beschickt w erden. D ie Säulen sin d dopp elw an d ig a u sg e fü h rt u n d bei 30 bzw. 50° C th e rm o s ta tis ie rt. Z u r D ru c k k o n tro lle sin d M anom eter ein g eb au t. D ie L änge d er S äulen b e trä g t 150, 50 u n d 15 cm. I n d e r 150 cm -Säule w erden die sauren
* V o rg e tr a g e n v o n R . D o ep fm er
u n d n e u tra le n A m inosäuren g e tre n n t. D ie E lu tio n e rfo lg t a u to m a tisc h in zw ei
D ie G e nauigkeit d e r beschriebenen M ethode lieg t n ach unseren E rf a h ru n g e n bei i 1% . D as hohe A uflösungsverm ögen d e r Io n e n au stau sch ersäu len g e s ta tte t es, b is zu 50 n in h y d rin -p o sitiv e K o m p o n en ten zu tre n n e n u n d q u a n t i ta ti v zu bestim m en. D e r en tsch eid en d e N a ch teil dieses V erfahrens lie g t aber in seinem hohen K o sten - u n d Z eitau fw an d . Z u r D u rc h fü h ru n g ein er V o llan a
lyse von k o m p lizierten A m inosäuregem ischen, wie sie im S perm a vorliegen, b e n ö tig t m an 2 Tage.
Z ur B estim m u n g fre ie r A m inosäuren im S perm a gehen w ir n a c h folgen
d em A rb e itsp lan vor:
F risch sp erm a w ird zu n ä ch st m it einem Ü berschuß an l% ig e r P ik r in säurelösung v e rse tz t, u m die v o rh an d en en P ro te in e zu en tfern en . N ach A bzen
trifu g ie re n des N iederschlages w ird das Ü b e rsteh en d e q u a n tita tiv d u rc h ein K iese lg u rfilte r g e k lä rt; d a n a c h w ird die überschüssige P ik rin sä u re m it H ilfe eines basischen A n io n en a u sta u sch erh arz es (Dow ex 1 x 8 ) e n tfe rn t. N achdem o rien tieren d e V orversuche m itte ls P ap ierc h ro m ato g ra p h ie gezeigt haben, daß eine R eihe von n ic h t id e n tifiz ie rb a re n P e p tid e n m it freien A m inosäuren v e r
gesellschaftet Vorkommen, h y drolysieren w ir das am in o säu reh altig e E lu a t d e r D ow ex 1 X 8 — K olonnen.
D ie A u fk lä ru n g d e r S tr u k tu r d e r g en a n n te n P e p tid e ste llte u ns v o r ein n ic h t zu bew ältigendes A rbeitsprogram m . D ie H y d ro ly se erfo lg t m itte ls 6 n HCl, w obei p ro 1 m l A usgangssperm avolum en 100 m l 6 n HCl v erw en d et w erden. D ie H y d ro ly se e rs tre c k t sich ü b e r 24 S tu n d e n bei 100° C. D abei n a h m en w ir allerd in g s den V erlust von T ry p to p h a n in K a u f. N ach d e r H y d ro ly se w erden ev e n tu e ll vorkom m ende H u m in sto ffe a b filtrie rt, u n d die Salzsäure lä ß t sich d a n n leich t im R o ta tio n sv e rd a m p fe r entfern en . D ie g etro ck n eten H y d ro ly sa te w erden m it einem N a -Z itra t-P u ffe r a u f p H 22 g eb rach t, wobei a u f das A usgangsvolum en des E ja k u la ts au fg efü llt w ird. N u r 0,5 m l dieser L ösung verw enden w ir zu r C h rom atographie a u f d e r eingangs beschriebenen A p p a ra tu r. M it H ilfe des angegebenen A rbeitsganges is t es m öglich, u n te r V erw endung von n u r seh r geringen M engen an A usgangsm aterial, alle im m enschlichen S perm a v o rkom m enden A m inosäuren ein d eu tig zu erfassen, v o n ein an d e r zu tren n e n u n d m it h o h er G enauigkeit zu bestim m en.
L IT E R A T U R 1. Be c k m a n n-R e p o r t (1959), 1.
2. Mo o s e, S., Sp a c e m a n, D . H ., St e i n, W . H . (1958), A n a ly t. C hem . 30, 1085.
3. Sp a c e m a n, D . H ., St e i n, W . H ., Mo o r e, S. (1958), A n a ly t. Chem . 30, 1090.
4. St e i n, W . H ., Mo o r e, S. (1954), J . biol. C hem ., 211, 915.
S ym p . Biol. H ung., 4, 63 — 77 (1964)