A cADPR törzsoldat tisztítása

Annak érdekében, hogy a cADPR saját hatását vizsgálhassuk, a mintát meg kellett tisztítanunk az ADPR szennyezéstől. Ehhez egy már közölt protokollt használtunk (105): cADPR törzsoldatunkat nukleotid pirofoszfatázzal (P7383, Sigma) kezeltük, amely az ADPR-t AMP-re és ribóz-5-foszfátra (ribóz-5-P) bontja, de érintetlenül hagyja a cADPR-t, majd az enzimet egy szűrő segítségével távolítottuk el az oldatból. Az esetleges artefaktok kiküszöbölése végett a folyamat sikerességét három szempontból is ellenőriztük.

19. ábra: A tisztítatlan cADPR hatása a TRPM2 csatornára.

A, Reprezentatív áramgörbe: telítési Ca²⁺ mellett 10 µM cADPR (Sigma C7344) jelentős áramot produkál, amelyet 10 μM ADPR hozzáadása csak kismértékben fokoz.

B, A tisztítatlan cADPR (Sigma C7344) normalizált dózis-hatás görbéje. A cADPR K½

értéke ~2-szer nagyobb, mint az ADPR-é azonos körülmények között.

C, Tipikus áramgörbe telítési Ca²⁺ és 1 µM cADPR (Sigma C7344) jelenlétében növekvő koncentrációjú ADPR-zal perfundált izolált membrános mérésekből.

D, Az ADPR 1 µM cADPR (Sigma C7344) jelenlétében mért normalizált dózis-hatás összefüggése. Az 1 μM cADPR jelenléte nem befolyásolta szignifikánsan az ADPR látszólagos affinitását.

Először az enzimatikus emésztés hatékonyságát vizsgáltuk vékonyréteg kromatográfiával (TLC) (20. A ábra). A vékonyrétegen megfuttatva a tisztítatlan cADPR esetében két körülírt foltot kaptunk, amelyek közül a gyorsabb együtt vándorolt a kontrollként felvitt ADPR-zal és denzitása alapján mennyisége körülbelül a minta 20%-ára volt tehető. Ezzel szemben a megtisztított cADPR esetében eltűnt az ADPR-nak megfelelő folt, és helyette egy új, lassabban migráló folt jelent meg, amely az AMP-vel együtt vándorolt, denzitása pedig a kezeletlen minta ADPR szennyezésének denzitásával volt összemérhető. Ez az eredmény egyrészt megerősítette, hogy az enzimatikus kezelés hatékonyan hasítja az ADPR-t, másrészt igazolta, hogy az enzim nem bontja le a cADPR-t, mivel a kezelt és kezeletlen mintában ennek denzitása nem változott. A másik hasítási termék, a ribóz-5-P, azért nem látható a TLC-n, mert nem fluoreszkál a megjelenítéshez használt UV fény hatására.

Másodszor, számolnunk kell azzal, hogy tisztított cADPR oldatunk AMP-t és ribóz-5-P-ot is tartalmaz. A TLC alapján becsülve a tisztított cADPR 10 μM koncentrációjú oldatában 2-5 μM AMP, illetve ribóz-5-P található. Ezért megvizsgáltuk, hogy e két lebontási termék befolyásolja-e a TRPM2 csatorna kapuzását. Azonban e kontroll kísérletekben sem 100 μM AMP, sem 100 μM ribóz-5-P külön-külön, illetve együttesen történő alkalmazása nem befolyásolta 1, illetve 32 μM ADPR aktiváló hatását telítési Ca²⁺ mellett.

Végül, bár a 24 kDa-os enzim eltávolítására Heiner és mtsai által javasolt (105) 10 kDa-os vágópontú szűrőoszlop megfelelő választásnak tűnt, funkcionálisan is igazolni akartuk e kritikus lépés hatékonyságát. Kísérleteinkben ugyanis a szinergia vizsgálatához szerettük volna együtt alkalmazni a tisztított cADPR-t és az ADPR-t.

Amennyiben azonban a cADPR törzsoldatban marad enzimatikus aktivitás, akkor az a mindkét nukleotidot tartalmazó oldatokban az ADPR lassú degradációjához vezethet, s így látszólagos gátlást okozhat. Mivel a TRPM2 csatorna aktivitása az ADPR koncentrációra az 1 μM-os koncentráció környékén a legérzékenyebb, ezért 1 μM-os ADPR oldatok aktiváló hatásának időbeli monitorozása segítségével határoztuk meg a maradék pirofoszfatáz aktivitást. Először átszűrtünk a 10 kDa-os szűrőoszlopon az enzimből annyit, amennyit egy csomag cADPR tisztításához is felhasználtunk. Majd az 1 μM ADPR-t tartalmazó kádoldatunkhoz hozzáadtunk a szűrletből egy akkora térfogatot, amely a hasonlóképpen átszűrt tisztított cADPR törzsoldat esetén 10 μM-os

20. ábra: A cADPR tisztítási eljárás vizsgálata.

A, TLC kép (balról jobbra) AMP, enzimatikusan tisztított cADPR, ADPR, nem kezelt cADPR. Látható, hogy az enzimatikusan tisztított cADPR mintából eltűnt az ADPR szennyezés, és helyette megjelent egy AMP-nek megfelelő folt.

B-D, Nominálisan 1 μM ADPR aktiváló hatása különböző nukleotid pirofoszfatáz szűrletek jelenlétében, illetve hiányában (125 μM Ca²⁺ mellett). A B és C mérésben alkalmazott szűrlet elkészítéséhez 10-kDa, illetve 3-kDa vágópontú (MWCO) szűrőoszlopot használtunk, a D méréshez használt szűrletet pedig kétszer engedtük át 3-kDa vágópontú szűrőoszlopon. A bekeretezett időmegjelölések a szűrlet tesztoldathoz történt hozzáadása és a mérés kezdete között eltelt időt jelzik.

E, Az 1 μM ADPR-t, 125 μM Ca²⁺-ot és nukleotid pirofoszfatáz szűrletet tartalmazó tesztoldatok által aktivált áramok a tesztoldat összemérése és a mérés kezdete között eltelt idő függvényében. Az egyes görbék a különböző protokollokkal készült szűrletekkel kapott eredményt mutatják: fekete négyzetek, 1x szűrés 10-kDa vágópontú szűrővel; fehér körök 1x szűrés 3-kDa vágópontú szűrővel; fekete körök, 2x szűrés 3-kDa vágópontú szűrővel.

végkoncentrációt eredményezett volna. Az így kapott tesztoldat és az 1 μM "kezeletlen"

ADPR oldat által aktivált TRPM2 áramot hasonlítottuk össze izolált membrános mérésekben, a tesztoldat elkészítése után különböző időpontokban. Meglepetésünkre, a tesztoldat TRPM2 áramot aktiváló képessége 2-3 órával a szűrlet hozzáadása után rohamosan csökkent, majd teljesen megszűnt. A 20. B ábra egy tipikus mérést mutat körülbelül 3 és fél órával a tesztoldat összemérése után. Látható, hogy a szűrlettel kiegészített ADPR tesztoldat ekkor már csak néhány csatornát aktivált, még a

"kezeletlen" ADPR-t tartalmazó oldat jelentős áramot adott. A tesztoldat aktiváló képességének ez az időfüggő csökkenése (20. E ábra, fekete négyzetek) arra utalt, hogy a szűrletben maradt pirofoszfatáz aktivitás, ami fokozatosan lebontja az ADPR-t a tesztoldatban. A szennyeződésként visszamaradó enzim mennyiségének csökkentése céljából egy másik, hasonló adag pirofoszfatázt 3 kDa-os vágópontú szűrőoszlopon szűrtünk át, majd hasonlóképpen teszteltük ezt a szűrletet is. A 20. C ábrán bemutatott mérés több mint 5 órával e szűrletet tartalmazó tesztoldat összemérése után készült, ez az oldat mégis jelentős TRPM2 áramot aktivált. Bár az ADPR tesztoldat aktiváló hatásának időfüggő csökkenése ebben az esetben is kimutatható volt, a csökkenés sebessége lényegesen mérséklődött (20. E ábra, fehér körök). Végül egy harmadik, azonos adag enzimet egymás után két 3 kDa-os vágópontú szűrőoszlopon szűrtünk át.

Ezt a szűrletet 1 μM ADPR-hoz hozzáadva, még 9 óra elteltével sem tapasztaltunk csökkenést a tesztoldat TRPM2-t aktiváló képességében (20. D ábra, 20. E ábra, fekete körök). Vagyis, ezzel a tisztítási protokollal a teljes enzimaktivitás eltávolítható az oldatból.

Ezek az eredmények a következőkről győztek meg minket: a pirofoszfatáz valóban lebontja a cADPR törzsoldatban levő ADPR szennyezést; a keletkező bomlás termékek nem befolyásolják a TRPM2 csatorna működését; az oldat az enzimtől is megtisztítható két 3 kDa-os vágópontú szűrőoszlop segítségével. A biztonság kedvéért azokban a mérésekben, ahol a tisztított cADPR-t és az ADPR-t együtt alkalmaztuk, az oldatot mindig a cADPR hozzáadása után 3 órán belül használtuk fel.