Alkalmas-e a T5L mutáns a TRPM2 kapuzásának modellezésére?

A maximálisan aktiválható T5L csatornák száma még hosszú mérések során is

ahhoz, hogy a TRPM2 ADPR-, illetve Ca²⁺-függő kapuzásának részletes biofizikai vizsgálatához használhassuk, előbb meg kellett bizonyosodnunk arról, hogy a T5L pórusmutáció nem változtatta meg a csatorna működését. Ennek igazolására makroszkópos mérésekben összehasonlítottuk a vad típus és a T5L variáns aktivációjának ADPR és Ca²⁺ koncentráció-függését, illetve egyedi- csatornás mérések segítségével megvizsgáltuk, hogy a mutáns alapvető kapuzási paraméterei eltérnek-e a vad típusú csatornára jellemző értékektől (52).

4.3.4.1. Vad típusú és T5L mutáns csatorna ADPR és Ca²⁺ iránti affinitásának összehasonlítása makroszkópos mérésekben

Először az ADPR aktiváló hatását vizsgáltuk telítési Ca²⁺ jelenlétében. Az ADPR mindkét típusú csatornát koncentráció-függő módon aktiválta (25. A ábra). Az egyes koncentrációk mellett mért áramokat a 32 μM ADPR-ban mérthez normalizálva elkészítettük a csatornák ADPR dózis-hatás összefüggését (25. B ábra), amelyeket a Hill-egyenlettel illesztettünk. A kapott paraméterek (vad típus: K½ = 1,1±0,1 μM, nH = 2,0±0,2; T5L: K½ = 1,4±0,1 μM, nH = 1,8±0,2) alapján a mutáció nem befolyásolta lényegesen az ADPR iránti látszólagos affinitást.

Ezután a kétféle csatorna típus aktivációjának Ca²⁺ koncentráció-függését hasonlítottuk össze telítési ADPR jelenlétében (25. C ábra). A mért áramokat a 125 μM Ca²⁺-ban mérthez normalizáltuk, és az így kapott dózis-hatás görbéket szintén a Hill-egyenlettel illesztettük (25. D ábra). A kapott paraméterek (vad típus: K½ = 22±1 μM, nH = 1.6±0,1; T5L: K½ = 31±2 μM, nH = 1.8±0,2) ebben az esetben is nagyon hasonlónak adódtak.

A vad típusú TRPM2 csatorna egyik jellegzetessége, hogy teljesen eltérő kinetikával reagál a két aktiváló ligand hirtelen elvonására. ADPR jelenlétében az intracelluláris Ca²⁺ pillanatszerű elvonásakor a csatornák rendkívül gyorsan bezárnak (τ

~ 50 ms; 25. C ábra). Ez arra utal, hogy a Ca²⁺ kötőhelyek nyitott állapotban is szabadon hozzáférhetők, így az intracelluláris Ca²⁺ elvonásakor a kötött Ca²⁺ gyorsan disszociálhat, és a csatorna bezáródhat. Ezzel szemben, ha Ca²⁺ jelenlétében az ADPR-t vonjuk el, akkor a vad típusú csatornák két nagyságrenddel lassabban csukódnak be (τ = 2751±203 ms, n = 10; 25. A ábra). Ez alapján megállapítható, hogy a csatorna nyitott

25. ábra: A T5L mutáns és a vad típusú TRPM2 kapuzásának összehasonlítása makroszkópos mérésekben.

A, Emelkedő koncentrációjú ADPR és telítési Ca²⁺ jelenlétében, -20 mV-on mért makroszkópos vad típusú (bal) és T5L (jobb) csatorna áramok. Az ADPR elvonását követő záródási sebesség jellemzéséhez az áramgörbékre exponenciálist illesztettünk (kék és piros vonal).

B, Az ADPR vad típusú (kék) és T5L (piros) TRPM2-re gyakorolt aktiváló hatását jellemző normalizált dózis-hatás összefüggések 125 µM Ca²⁺ jelenlétében. A vonalak a Hill-egyenlettel való illesztést ábrázolják.

C, Emelkedő koncentrációjú Ca²⁺ és telítési ADPR jelenlétében, -20 mV-on mért makroszkópos vad típusú (bal) és T5L (jobb) csatorna áramok. A Ca²⁺ elvonását követő záródási sebesség jellemzéséhez az áramgörbékre exponenciálist illesztettünk (kék és piros vonal).

D, A Ca²⁺ vad típusú (kék) és T5L (piros) TRPM2-re gyakorolt aktiváló hatását jellemző normalizált dózis-hatás összefüggések 32 µM ADPR jelenlétében. A vonalak a Hill-egyenlettel való illesztést ábrázolják.

állapotában a NUDT9-H doménhez kötődő ADPR nem tud gyorsan egyensúlyba kerülni az intracelluláris oldalt perfundáló oldattal. Ennek többféle magyarázata is lehet:

elképzelhető, hogy az ADPR nagyon erősen kötődik a csatornához, vagy a nyitás során bekövetkező konformáció-változás következtében az ADPR kötőhelye bezáródik, és nem hozzáférhető az oldat számára. Bár a valós okot nem ismerjük, azt mindenesetre megállapíthattuk, hogy ez a markáns kinetikai különbség megmaradt a T5L mutáns esetében is: a vad típusúhoz hasonlóan, a mutáns csatornák is Ca²⁺ elvonásakor gyorsan, míg ADPR elvonásakor lassan záródnak be (25. A és C ábrák).

4.3.4.2. Vad típusú és T5L mutáns csatorna kapuzási paramétereinek összehasonlítása egyedi-csatornás mérésekben

A makroszkópos mérésekben kapott eredmények nagyon biztatók voltak, ezért megvizsgáltuk azt is, hogy vajon a T5L pórusmutáció befolyásolja-e a steady-state egyedi-csatornás mérésekből meghatározható kapuzási paramétereket. A T5L mutánssal ezek a mérések egyszerűen kivitelezhetők, azonban a vad típusú csatorna esetében körülményesek. Mivel kutatócsoportunk már korábban publikálta a vad típusú csatorna átlagos kapuzási paramétereinek Ca²⁺ koncentráció-függését (52), ezért az ott leírt értékeket használtuk kontrollnak (26. C ábra, kék oszlopok), és jelen munkában csak a T5L mutánst vizsgáltuk. Három paramétert határoztuk meg alacsony (4 μM), illetve telítési (125 μM) [Ca²⁺] mellett (mindkét esetben 32 μM ADPR jelenlétében): a nyitvatartási valószínűséget (Po), az átlagos nyitási sebességet (kco) és az átlagos záródási sebességet (koc). Telítési Ca²⁺ koncentrációnál a steady-state egyedi csatorna elemzésekhez a 26. B ábrán láthatóhoz hasonló, maximum 10 aktív csatornát tartalmazó, patch-eket használtunk fel. Ilyen körülmények között a csatornák Po-ja nagyon magas – közel 1 –, így számuk pontosan megállapítható. Ezzel szemben 4 μM Ca²⁺ mellett a csatornák csak nagyon ritkán nyitnak, ezért ahhoz, hogy ilyen körülmények között is kapjunk elegendő eseményt az elemzéshez, néhány száz csatornát tartalmazó patch-eket kellett használnunk, amelyekben a tényleges csatornaszámot a vizsgált szakasz után alkalmazott telítési Ca²⁺ jelenlétében határoztuk meg (26. A ábra). A 3.4.4.4. fejezetben leírt algoritmussal becsült paraméterek a 26. C ábrán láthatók (piros oszlopok). A középső diagramon szerepel még egy harmadik,

26. ábra: A T5L mutáns és a vad típusú TRPM2 kapuzásának összehasonlítása egyedi csatorna mérések elemzésével.

A, 4 μM citoszólikus Ca²⁺ (és 32 μM ADPR) mellett az egyedi csatorna események tisztán feloldhatóak maradnak (szürke keretben kiemelt szakasz), még akkor is, ha a patch nagyszámú T5L csatornát tartalmaz. A csatornák számát (N) az egyedi csatorna áram amplitúdójának ismeretében, a vizsgált szakaszt követően alkalmazott 125 μM Ca²⁺ (és 32 μM ADPR) jelenlétében mért áram alapján becsültük meg. A membránpotenciál -20 mV volt.

B, A T5L csatorna steady-state kapuzását – 125 μM Ca²⁺ (és 32 μM ADPR) mellett – néhány csatornát tartalmazó patchekben (itt: N=10) vizsgáltuk (baloldali áramgörbe).

Az egyedi csatorna események könnyebb megtekintése céljából a világoskék színnel kiemelt szakasz a jobboldali szürke keretben hosszabb időskálán is látható. A membránpotenciál -20 mV volt.

C, 4 és 125 μM Ca²⁺ (és 32 μM ADPR) jelenlétében -20 mV-on végzett steady-state egyedi csatorna mérések (lásd A és B ábra) elemzésével nyert kapuzási paraméterek:

nyitási sebesség (bal), zárási sebesség (közép) és nyitvatartási valószínűség (jobb). A 8 nM Ca²⁺-hoz tartozó záródási sebesség értékek (csíkozott oszlopok) a makroszkópos mérésekben intracelluláris Ca²⁺ elvonását követően megfigyelhető záródási sebességet jelentik (lásd: 25. C ábra, illetve 33. B ábra háromszögek). Steady-state egyedi csatornás méréseket csak a T5L-csatornával végeztünk, a vad típusú csatornához tartozó kapuzási paraméterek egy már korábban publikált cikkből származnak (Csanady, L. and

sávozott oszlop is, amely 8 nM Ca²⁺ jelenlétében mutatja a csatornák becsült záródási sebességét. Mivel ilyen körülmények között a TRPM2 csatorna nyitási sebessége gyakorlatilag nulla, ezért ez a paraméter steady-state mérésekből nem becsülhető;

ehelyett makroszkópos mérésekből határoztuk meg, mint a Ca²⁺ hirtelen elvonását követő áramrelaxáció időállandójának inverzét (lásd 25. C ábra; "Ca²⁺"-mentes kádoldatunkban a becsült szabad [Ca²⁺] ~ 8 nM). A makroszkópos Ca²⁺ affinitás mérésekkel (25. C és D ábra) összhangban, a T5L mutáns mikroszkópos kinetikai paraméterei is a vad típushoz nagyon hasonlónak adódtak. A Ca²⁺ koncentráció növekedésével emelkedő Po mindkét esetben a záródási sebesség csökkenéséből, illetve a nyitási sebesség növekedéséből adódik; a záródási sebességnek a nyitásihoz viszonyított nagyobb (szubmikromólos) Ca²⁺ érzékenysége pedig arra utal, hogy mindkét típusú csatorna erősebben köti a Ca²⁺-ot nyitott, mint csukott állapotban.

Tehát a T5L pórusmutáció – amellett, hogy megszüntette a vad típusú csatornára jellemző gyors inaktivációt, ezáltal ideális körülményeket teremtve a steady-state csatorna elemzésekhez – sem a makroszkópos affinitás terén, sem a mikroszkópos kapuzási paraméterek vonatkozásában nem változtatta meg a csatorna működését, így a T5L mutáns nagyszerű modell lehet a TRPM2 csatorna ADPR, illetve Ca²⁺-függő kapuzási mechanizmusának tisztázására.