Az NHERF2 szerepe az ERM foszforilációjában

Az ERM fehérjék foszforilációval aktiválódó fehérje-linkerek. Az NHERF2 és a foszforilált ERM fehérjék közötti kölcsönhatást immunfluoreszcens kísérlettel, foszfo-ERM és NHERF2 fehérjékre specifikus antitestekkel vizsgáltuk BPAEC-ben. Osztódó sejteken a fehérjék ko-lokalizációját detektáltuk a plazmamembránban és a filopódiumokban a mitózis minden fázisában (4.2.14 ábra, A). BPAEC-t nokodazol kezeléssel (80 ng/ml, 16 h) G2/M fázisban blokkoltunk, majd NHERF2 elleni antitesttel immunprecipitációt végeztünk (4.2.14. ábra, B). A nem szinkronizált sejtekhez

4.2.13 ábra Az EBP50 és az NHERF2 kölcsönhatása az ERM fehérjékkel eltérő. (A) BPAEC lizátumból EBP50 és NHERF2 elleni antitestekkel végzett immunprecipitáció után a minták Western blot vizsgálata ERM, EBP50 és NHERF2 specifikus antitestekkel. Negatív kontrollként nyúl szérummal készült immunprecipitátumot használtunk (IP-nyúl szérum). (B) BPAEC-ben c-myc tag-gel ellátott ezrin, radixin és moezin fehérjék Anyagok és módszerek fejezetben leírt overexpressziója után immunprecipitációt végeztünk c-myc elleni antitesttel. A sejtlizátumokat és az immunprecipitátumokat c-myc, EBP50 és NHERF2 elleni antitestekkel Western blot kísérletben vizsgáltuk. Negatív kontrollként antitest nélküli immunprecipitátumot használtunk (IP-ØAB). 

viszonyítva a nokodazollal kezelt sejtek lizátumában az immunfluoreszcens vizsgálatok alapján vártnak megfelelően a foszfo-ERM jel erősödött, továbbá az NHERF2 immunkomplexében a G2/M fázisban lévő sejtekből készült mintában szintén jelentősen nagyobb mennyiségű foszfo-ERM-et detektáltunk.

4.2.14 ábra Mitózis során a foszfo-ERM kötődik az NHERF2-höz. (A) BPAEC immunfestése NHERF2 és foszfo-ERM elleni antitesttekkel. A sejtciklus fázisait a magok TO-PRO-3-Iodide festése alapján határoztuk meg. Lépték: 10 µm. (B) Kezeletlen és nokodazollal kezelt (80 ng/ml, 16 óra) (ND) BPAEC lizátumokból NHERF2-t immunprecipitáltunk a fehérjére specifikus antitesttel. A sejtlizátumokat és az immunprecipitált mintákat ERM, foszfo-ERM és NHERF2 elleni specifikus antitestekkel vizsgáltuk Western blot kísérletben.  

A

B

BPAEC-ben specifikus siRNS transzfekcióval csendesítettük az NHERF2 fehérjét, hogy ellenőrizzük, változik-e az ERM foszforilációja az előzőek alapján feltételezhetően szabályozó fehérje hiányában. A csendesítés hatékonyságát Western blottal ellenőriztük.

Azt is megállapítottuk, hogy az NHERF2 depléciója az EBP50 fehérje szintjét nem befolyásolta (4.2.15 ábra, A). A kontroll és nsRNS-sel transzfektált minták esetében a nem szinkronizált sejtlizátumokban detektált alacsony foszfo-ERM szint a G2/M fázisban szinkronizált sejtekben azonos mértékben emelkedett (4.2.15 ábra, B). Az NHERF2 csendesített BPAEC lizátumokban azonban a nokodazol kezelés után is alacsony maradt az ERM foszforilációs szintje (4.2.15 ábra, B), amit immunfluoreszcens vizsgálattal is megfigyeltünk (4.2.15 ábra, E). Az egyesített képeken a magfestés alapján jól felismerhetőek a mitotikus sejtek. Míg az nsRNS transzfekció után a foszfo-ERM és NHERF2 ko-lokalizációja látható a filopódiumokban, az osztódó, NHERF2 depletált sejten sem ko-lokalizációt, sem a foszfo-ERM jel erősödését nem tapasztaltuk.

Mindezekből azt a következtetést vontuk le, hogy az NHERF2 egy szükséges faktor az ERM foszforilációjában.

Feltételeztük, hogy az NHERF2 adaptor fehérje kötődési felületet biztosíthat az ERM és az ERM-t foszforiláló kináz számára. A Rho kináz egyike azoknak a kinázoknak, melyről ismert volt, hogy az ERM-t foszforilálhatja [195]. A ROCK2 kináz inhibitorával, H1152-vel előkezelt BPAEC-ben a nokodazol által kiváltott foszfo-ERM szint növekedés jelentősen lecsökkent a kontrollhoz viszonyítva (nincs dokumentálva), amiből arra következtettünk, hogy a ROCK2 lehet felelős az ERM foszforilációjáért az EC-ben.

Tovább vizsgálva az NHERF2-ERM-ROCK2 kölcsönhatásokat azt találtuk, hogy az NHERF2 és a ROCK2 elleni BPAEC immunprecipitátumokban az adaptor és a kináz egyaránt jelen volt (4.2.15 ábra, C), és az ERM-t is detektáltuk kontroll és nsRNS-sel transzfektált BPAEC ROCK2 immunprecipitátumában (4.2.15 ábra, D). Bár az ERM fehérjeszint az NHERF2 depletált BPAEC lizátumában nem különbözött a két kontroll mintában talált mennyiségtől, a csendesített sejtekben az ERM ROCK2-höz való kötődése megszűnt (4.2.15 ábra, D), igazolva feltételezésünket.

A fenti eredményekkel összhangban, az NHERF2 overexpressziója a foszfo-ERM szint növekedését eredményezte (4.2.16 ábra, A-B). Vad típusú és mutáns NHERF2 overexpressziójára alkalmas pCMV-HA expressziós konstruktokat készítettünk. A mutáns forma C-terminálisáról az ERM kötő domént eltávolítottuk. A kontroll és overexpresszáló BPAEC minták lizátumában Western blottal összehasonlítottuk a foszfo-

4.2.15 ábra NHERF2 hiányában az ERM nem foszforilálódik a mitózis során. (A) Nem transzfektált (kontroll), nem specifikus (nsRNS) és NHERF2-re specifikus (sc-42522) siRNS-sel transzfektált BPAEC lizátumok Western blot vizsgálata EBP50, NHERF2 és aktin elleni antitestekkel. (B) Nem transzfektált (kontroll), nem specifikus (nsRNS) és NHERF2-re specifikus (sc-42522) siRNS-sel transzfektált BPAEC-ből további kezelés nélküli vagy nokodazol kezelést követően készült lizátumok Western blot vizsgálata foszfo-ERM, ERM, NHERF2 és aktin elleni antitestekkel. (C) BPAEC sejtlizátumokból NHERF2 és ROCK2 fehérjéket immunprecipitáltunk. A mintákat immunoblottal vizsgáltuk ROCK2 és NHERF2 elleni antitestekkel. (D) Nem transzfektált (kontroll), nem specifikus (nsRNS) és NHERF2-re specifikus (sc-42522) siRNS-sel transzfektált BPAEC lizátumokból ROCK2 fehérjét immunprecipitáltunk. A sejtlizátumokat és az immunprecipitált mintákat Western blottal ROCK2, ERM és NHERF2 elleni antitestekkel teszteltük. (E) Nem specifikus (nsRNS) és NHERF2-re specifikus siRNS-sel transzfektált BPAEC immunfestése NHERF2 és foszfo-ERM elleni antitestekkel.

A sejtmagokat TO-PRO-3-Iodide festéssel tettük láthatóvá. 

E

ERM mennyiségét. Míg a vad típusú NHERF2 rekombináns ~50%-os foszfo-ERM szint növekedést váltott ki, az ERM-mel kötődni nem képes mutáns overexpressziója a kontrollhoz viszonyítva nem okozott az ERM foszforilációjában eltérést (4.2.16 ábra, A).

A vad típusú NHERF2-t overexpresszáló sejteken erős filopódium képződést figyeltünk meg a belső kontroll és a mutánst overexpresszáló BPAEC-hez hasonlítva (4.2.16 ábra, B), valamint a rekombináns NHERF2 ko-lokalizál a foszfo-ERM-mel (4.2.16 ábra, C).

4.2.2.2.3 Az NHERF2 segíti az EC szétterülését (spreading) és az angiogenezist