A protein foszfatáz 2A szerepe az endotél barrier

Az endotél permeabilitás szabályozásában a miozin foszfatáz mellett a PP2A is részt vehet. Egyrészt más sejttípusokban végzett vizsgálatok igazolták a PP2A és a

citoszkeleton fehérjéi közötti kapcsolatot [105, 107, 108, 112, 113], másrészt az endotél sejtek esetében is születtek olyan eredmények, amelyek a PP2A szerepére utaltak az EC citoszkeleton szerkezetének szabályozásában [85, 116, 117]. Kezdeti vizsgálataink során a PP2A specifikus gátlása következtében nem találtunk szembetűnő változást az EC F-aktin és mikrotubulus szerkezetében. Ha a tenyésztő folyadékban még optimális, de alacsonyabb szérum koncentrációt alkalmaztunk (20 helyett 10%), a PP2A specifikus gátlása a sejtek kontrakcióját, az F-aktin és a mikrotubulusok átrendeződését váltotta ki.

HPAEC immunfestése a PP2A és a mikrotubulusok kolokalizációját mutatta, valamint a mikrotubulusok és a PP2A közötti asszociációt, amit korábban endotél és epitél sejtekben is leírtak [112, 116], sikerült sejtfrakcionálással is igazolnunk. A mikrotubulusok felbomlása együtt jár az MLC foszforilációs szintjének és az F-aktin mennyiségének emelkedésével [14], vagyis a sejtkontrakció/barrier diszfunkció és a mikrotubulusok stabilitása korrelálnak. Okadánsavval, a PP2A gátlószerével előkezelt EC érzékenyebben reagált a mikrotubulusokat feloldó nokodazol kezelésre (nincs dokumentálva) TER mérések során, ami alapján arra következtettünk, hogy a PP2A a mikrotubulusok stabilitását biztosítja és ezzel az endotél barrier/gát funkció fenntartását segíti elő.

A PP2A-t aktiváló jelátviteli pályákról kevés információ áll rendelkezésre. Ke és mtsai [221] például a Pak1 (P21-activated kinase-1) hatását vizsgálták trombin indukált EC barrier diszfunkcióban, és kimutatták, hogy az aktív Pak1 a barrier diszfunkciót a PP2A aktivitás fokozásával gátolja. Tranziens emlős és adenovírus expressziós rendszerrel over-expresszálva a PP2A-t különböző módszerek (immunfluoreszcencia és TER mérések) alkalmazásával is igazoltuk a PP2A aktív szerepét az EC citoszkeleton szerkezetének és barrier funkciójának fenntartásában.

A B regulátor család tagjai közül a sejtekben általánosan előforduló Bα izoformát vizsgáltuk. A Bα alegység csendesítése után humán és marha tüdő artéria EC immunfluoreszcens és TER vizsgálatai fenti eredményeinkkel összhangban ugyancsak a PP2A részvételét igazolták az EC citoszkeleton és barrier szabályozásában. Az alegység hiányában az F-aktin mennyisége nőtt a sejtekben, és a trombin kezelésre is érzékenyebben reagáltak, ami arra utal, hogy az ABαC holoenzim forma játszik szerepet a citoszkeletális szubsztrátok defoszforilációjában.

Reverzibilis foszforilációval szabályozott fehérjék, a mikrotubulusokhoz asszociálódó tau, valamint az aktin polimerizációban szerepet játszó HSP27

kölcsönhatását vizsgáltuk a PP2A-val. A defoszforilált tau elősegíti a mikrotubulusok kialakulását és stabilizálja is azokat. A tau foszforilációjában több kináz szerepét is leírták, aminek fontosságát az jelzi, hogy a foszforiláció csökkenti a fehérje mikrotubulusokhoz való kötődési és stabilizáló képességét [111, 222-224]. A HSP27 a stressz-aktivált p38 MAP kináz kaszkád egyik terminális szubsztrátja [225], ami foszforilált formájában elősegíti az aktin polimerizációt [117, 226]. Tüdő artéria EC vizsgálatával közvetlen kapcsolatot találtak a p38 MAPK aktiváció és a miktrotubulusok átrendeződése, valamint az EC barrier szabályozás között [227].

EC frakcionálás során mindkét fehérjét a PP2A-val azonos, a tubulinban gazdag frakcióban találtuk. Sejtkontrakciót kiváltó kezelések (nokodazol és trombin) következtében mindkét fehérje foszforilációs szintje megnőtt, azonban a PP2A-t overexpresszáló sejtekben a kezelés ellenére megőrzött maradt a citoszkeleton szerkezete,

5.2.1 ábra A PP2A részt vesz az EC citoszkeleton szerkezetének (A) és adherens kapcsolatainak (B) szabályozásában. 

miközben a tau és a HSP27 foszforilációs szintje is alacsony maradt. Ebből arra következtethetünk, hogy a PP2A a tau defoszforilációjával elősegíti a mikrotubulusok stabilitását, másrészt a HSP27 defoszforilációjával mérsékli az F-aktin kialakulását, azaz mindkét folyamat által az EC barrier fenntartását segíti (5.2.1 ábra, A). Újabb eredmények neuroendokrin PC12 sejtek citoszkeleton szerkezetének átrendeződésében a tau és a HSP27 foszforilációját, valamint a p38 MAPK és PP2A szerepét támasztják alá [228].

Annak eldöntésére, hogy a PP2A közvetlenül, vagy közvetve szabályozza a két fehérje defoszforilációját, további vizsgálatokra van szükség. A PP2A nagyszámú B regulátor alegysége révén változatos holoenzim formában fordul elő a sejtekben, ezért számos fehérje partnere között a tau és a HSP27 fehérjéken túl még további, az EC citoszkeletont és permeabilitást befolyásoló fehérje szubsztrátja lehet.

A Bα alegység és ezzel együtt a PP2A, eredményeink szerint az EC adherens kapcsolatok szabályozásában is részt vesz. A PP2A specifikus gátlása és a Bα csendesítése egyaránt az EC adherens sejtkapcsoló fehérjéinek lokalizáció változását váltotta ki, jelezve a sejtkapcsoló struktúrák felbomlását. Hasonlóan, humán keratinociták okadánsavas kezelését követően Serres és mtsai [229] az E-kadherin, Beckers és mtsai [230] HUVEC trombin kezelése után pedig a β-katenin transzlokációját találták a membránból a citoplazmába. Ezek a kezelések a citoszkeletont módosítják, a sejtek összehúzódnak, ami magyarázhatja a sejtkapcsoló struktúrák felbomlását.

A két vizsgált sejtkapcsoló fehérje kölcsönhatását számos oldalláncuk (Ser/Thr és Tyr) foszforilációja befolyásolja, melyek gátolják vagy stabilizálják kötődésüket [23, 122]. Ezért feltételezhető, hogy a sejtkapcsoló struktúrák felbomlása is a protein kináz és foszfatáz aktivitások eltolódott egyensúlyával, a VE-kadherin és/vagy a β-katenin megváltozott foszforilációs szintjével indokolható. Ezt a feltételezést támasztja alá az a korábbi eredmény is, ami a PP2A aktivitás jelentőségére hívja fel a figyelmet az E-kadherin/β-katenin kölcsönhatás stabilizálásában [231]. Pull-down módszerrel fehérjekölcsönhatást mutattunk ki a rekombináns Bα és az EC VE-kadherin, illetve a β-katenin között. Továbbá a β-β-katenin Ser552 oldallánc foszforilációja az EC PP2A gátlószerrel való kezelése vagy a Bα csendesítést követően jelentősen, az alacsony kontroll érték többszörösére nőtt. A Ser552 foszforilációja és a β-katenin adherens sejtkapcsolatokban való jelenléte közötti kapcsolatot mások is leírták karcinoma és simaizom sejteken [126, 232]. A PP2A gátlás/Bα csendesítés után a β-katenin foszforilált formáját döntően a citoplazmában detektáltuk. Ebből arra következtettünk, hogy a PP2A

a β-katenin Ser552 oldalláncának defoszforilációjával részt vehet az EC adherens sejtkapcsolatok fenntartásában, ezzel is hozzájárulva a jól működő endotél barrierhez (5.2.1 ábra, B). Az agyban az EC integritásában a PP2A aktivitás jelentőségét egy másik munkacsoport közlése [233] is igazolja.