Az EGFR és az integrinek kölcsönhatásának szerepe asztrocitómákban

3.5.1. Az ErbB1 (EGFR) és az integrin-β1 közti molekuláris interakció vizsgálata asztrocitómákban

Intraoperatív friss fagyasztott II-es és IV-es grádusú asztrocitómák szöveti metszeteiről készültek fluoreszcencia energia transzfer (FRET) mérések konfokális mikroszkóp használatával. 10 db II-es grádusú asztrocitóma (életkor: 18-59 év, átlagos életkor 37,8 év, 5 férfi és 5 nő) és 10 db IV-es grádusú asztrocitóma (életkor: 42-73 év, átlagos életkor 61,4 év, 3 férfi és 7 nő) mintával dolgoztunk.

A szövetmintákat folyékony nitrogénben hűtött iso-pentánban (Sigma Aldrich, St.

Louis, MO) gyorsfagyasztottuk. A Tissue-Tek O.C.T.-be ágyazás után 15 µm széles metszeteket készítettünk a Shandon Cryotom rendszer segítségével (AS-0620E, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) -20 °C-on. A szilánnal burkolt tárgylemezekre helyezett metszeteket szárítottuk és 4%-os PFA-PBS-ben 30 percig fixáltuk, majd 1%-os BSA-PBS-ben 30 percen át blokkoltuk. Ezután 20 µg/mL Cy3 konjugált anti-ErbB1 antitesttel (Mab528) és 20 µg/mL Cy5 konjugált anti-integrin-β1 antitesttel (TS2 klón) jelöltük egy éjszakán át 4

°C-on inkubálva, majd 3x mostuk és glicerolban m°C-ontíroztuk. A hisztológiai meghatározás rutin patológiai vizsgálat során történt.

Antitestek

Az ErbB1 és integrin-β1, elleni antitesteket hibridóma sejtvonalak szupernatánsaiból nyertük: 528 (IgG2a, #HB-8509), TS2/16.2.1 (IgG1, #HB-243, ATCC, Manassas, VA) Sepharose 4B Fast Flow Protein G gyöngyök segítségével az IgG2a esetében és Protein A gyöngyökkel az IgG1esetében (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Az antitestek jelölése Cy3, és Cy5 (Amersham Biosciences Europe, Freiburg, Németország), festékekkel történt.

A sejtek antitesttel való jelölése

A mikroszkópos mérésekhez, a LabTek II fedőlemezeihez tapadt sejteket (Nalga Nunc International, Rochester, NY) 3x mostuk PBS-ben majd az X-FITC, Cy3 vagy a Cy5-tel konjugált antitestek telítő koncentrációval jelöltük jégen, 30 percen át. Ezután 3x PBS-ben mostuk és 500 µL 4 %-os formaldehid-PBS-ben fixáltuk 20 percen keresztül.

Konfokális mikroszkópiához egy Zeiss LSM510 CLSM (Carl Zeiss, Jena, Németország) készüléket alkalmaztunk Plan-Apochromat 63x/1.40NA olaj immerziós objektívvel és egy UV/488/543/633 sugárelosztóval. Az X-FITC, Cy3 és Cy5 fluroforokat 488, 543, és 633 nm-en excitáltuk és 505–535 nm, 560–605 nm band pass, és 650 nm long pass szűrőkkel detektáltuk. 1-3 µm vastag, 4x átlagolt optikai szekciókat (512 x 512 pixel 12 biten) képeztünk le multitrack módban, hogy a csatornák közötti interakciókat kiküszöböljük. A szöveti minták expressziós értékeinek meghatározására a képeket tile módban készítettük el.

Statisztikai analízis

Az analíziseket a SigmaStat 3.5.0.54 segítségével végeztük (Systat Software, Inc.). A II-es és IV-es grádusú asztrocitóma csoportokat kétmintás t-próbával vagy a normalitás hiányában Mann-Whitney teszttel vizsgáltuk, miután a normál eloszlást Kolmogorov-Smirnov szerint, Lilliefors’ korrekcióval ellenőriztük. Kettőnél több, normál eloszlást mutató csoport esetén ANOVA analízist és post-hoc Tukey's tesztet alkalmaztunk. Az ErbB1 és integrin-β1 expresszió és az ErbB1-integrin-β1 heteroasszociáció relapszus-mentes időre kifejtett hatását lépésenkénti többszörös lineáris regresszióval határoztuk meg. A fent említett paraméterek tumor grádusra vonatkozó prediktív erejét pedig lépésenkénti többszörös bináris logisztikus

Kaplan-Meier analízis segítségével vizsgáltuk. A statisztikai összehasonlítás illetve a szignifikanciaszint (p) becslése log-rank próbával történt.

3.5.2. Az EGFR mutáció szerepének vizsgálata rekurrens glioblasztómában

Betegek

A szövetmintákat a Debreceni Idegsebészeti Klinikán rekurrens GBM miatt operált betegek műtéte során gyűjtöttük. Összesen 20 olyan beteg mintáin végeztünk méréseket, akik korábban már átestek műtéti tumor reszekción illetve legalább radioterápián majd ezután újult ki a daganatuk.

A kis molekulasúlyú EGFR kináz inhibítor adjuváns terápia hatásának megbecsüléséhez az EGFR gén protein kináz doménjének, az EGFR fehérje expressziójának, az EGFR gén amplifikációjának és mutációjának vizsgálatát végeztük el rekurrens GBM mintákon az alább részletezett módszerekkel.

Immunhisztokémia

Az EGFR fehérje immunhisztokémiai vizsgálatát monoklonális antittesttel végeztük (2-18C9 klón; PharmDx Kit, DAKO, Glostrup, Denmark) a gyártó előírásainak megfelelően. A tumorsejtek ≥1 %-ának membránfestődése jelentette a pozitív eredményt.

Fluoreszcens in-situ hibridizáció (FISH)

A szövetmintákból 4 mikrométeres metszeteket készítettünk, melyeket a hibridizáció előtt Paraffin Pretreatment Reagent Kit II-vel kezeltünk (Vysis, IL, USA). A FISH vizsgálatot Spectrum-Orange-val jelölt EGFR génpróbával és Spectrum-Green-nell jelölt 7-es kromoszóma centromer régiójára specifikus referencia próbával végeztük (Vysis). A metszetek kontúr-festését 15 ng/ml 4',6-diamino-2-phenylindole-al (Vysis) végeztük. A zöld és piros jeleket 60 tumoros sejtmagban számoltuk meg szöveti mintánként.

DNS izoláció

Formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetmintákból 10 µm-es szeleteket vágtunk eldobható pengéjű mikrotóm segítségével. A deparrafinizált szöveteket proteináz K-tartalmú pufferben reszuszpendáltuk és 60 °C-on 16 órán keresztül inkubáltuk, amíg a szövetek teljesen

szolubilizálódtak. A DNS tisztítását EZ1 Biorobot és EZ1 DNS Tissue Kit segítségével végeztük (Qiagen, Hilden, Germany).

Nested PCR és DNS szekvenálás

Nyolc pár, az EGFR gén 18, 19, 20 és 21 exonjaira specifikus primert alkalmaztunk a a nested polimeráz lánc reakcióhoz (nPCR). Az első PCR 100 ng templát DNS-t tartalmazott, 300 nM forward és reverz primert, 5 µl Expand High Fidelity PCR (Roche, Basel, Switzerland) mester mixet, 2.6 U Expand High Fidelity enzim mixet (Roche) és 200 µM-et minden dNTP-ből 50 µl térfogatban. A PCR-el első körben amplifikált mintákat egy második körös nPCR vizsgálatnak is alávetettük. A második PCR 3µl-t tartalmazott az előzőből és 300 nM forward és reverz primert, 5 µl Expand High Fidelity PCR (Roche) master mixet, 2.6 U Expand High Fidelity enzim mixet (Roche) és 200 µM-et minden dNTP-ből 50 µl térfogatban.

A PCR ciklusok paramétereit az első ciklus során 94 °C-os denaturáció jellemezte 2 percen keresztül, majd 35 ciklus következett 94 °C-on egyenként 15 másodperc időtartamban (denaturáció), majd 56 °C 30 másodpercig (hőkezelés) és 72 °C 1 percig (extenzió). A PCR termékeket 2%-os agaróz gélen elektroforetizáltuk annak érdekében, hogy az egy szálú DNS jelenlétét igazolni tudjuk. A PCR termékeket a High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) segítségével tisztítottuk meg. A tisztított DNS szekvenálását a BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével végeztük 20 ng PCR termék, 3.2 pmol forward vagy rezerv primer illetve összesen 20 µl térfogatban lévő 8 µl Terminator Ready Reaction Mix felhasználásával. A szekvenálást követő DyeEx 2.0 Kit-el (Qiagen, Hilden, Germany) elvégzett tisztítás után az elektroforézist illetve az adatelemzést az ABI 310 Genetic Analizátor (Applied Biosystems) segítségével végeztük el.