Az autológ érgraft kísérlet eredményei

Az állatkísérletek eredményeit külön részletezem, de valójában egy vizsgálatról van szó. Az első, egy hónapos sorozat sikere után bátorkodtunk a hosszabb távú elemzésre.

Egy hónap után a jól tapintható femorális pulzus mellett jó Doppler ultrahang eredményeket mértünk az 5 sikeres graft esetén. A medián pulzus-hullám sebessége (flow-rate) fokozatosan növekedett, az első posztoperatív napon 331 cm/sec (124-400 cm/sec) és egy hónap után 383 cm/sec (200-500 cm/sec) volt. Ez az érték azonos volt az ellenoldali, kontroll csoportként számított femorális keringéssel. A graftok átlagos dilatációja 2,1 mm volt (1,2-3,1 mm). Nem találtunk aneurysma képződést és mind az 5 graft életképes volt. Nekrózist és adhéziókat nem láttunk a graftok eltávolítása során. A kivett graftok makroszkópos vizsgálata során sima lumeni felszín volt a jellemző és az anasztomózisok is hemodinamikailag elfogadható képet mutattak. A szövettani vizsgálatok során a natív, beültetés előtti RF lemez egy fascia szerkezetre jellemző

strukturát igazolt a fali peritoneum mesothel-sejt szigeteivel. Az egy hónap után eltávolított graftok szövettani vizsgálata életképes szöveteket igazolt aktív fibroblasztokkal és simaizom elemekkel a belső felszín alatt. Továbbá egy vékony fibrin réteg is megjelent a graftok falában. Egy hónap után már nem láttunk mesothel sejteket a lumeni felszínen. A neoendothel mindkét oldalról bekúszott a graft felszínére. A középső harmadon egy vékony fibrinréteg borította az RF graftokat. Az anasztomózis szintjén makrophág sejteket és granulocytákat láttunk hypertrófia nélkül.

A második kísérlet sorozat során 8 kutyát operáltunk és 6 hónapig figyeltük a graftok működését immunszuppresszió alkalmazása mellett. További két graftot egy évig figyeltünk. Ezek után a graftokat széleskörű szövettani vizsgálattal is elemeztük.

A 8 graftból mind a 8 graft jól funkcionált 6 hónapon át. Az egy évig követett két graft szintén elfogadható tulajdonságokat mutatott. A pulzus és a Doppler vizsgálatok eredményei megfelelő artériás keringést igazoltak, összehasonlítva az ellenoldali femorális keringéssel.

A 8 graftból kettőnél disztális szűkületet találtunk a kivétel során, de a pulzus mindvégig tapintható volt ezen esetekben is. A Doppler vizsgálatok az első napon medián 345 cm/sec (110-430 cm/sec), egy hónap után 390 cm/sec (195-450 cm/sec) és hat hónap után 370 cm/sec (150-420 cm/sec) áramlási sebességet igazoltak. Az egy évig vizsgált két esetben átlagosan 355 cm/sec volt az áramlási sebesség. A kontrollként vizsgált ellenoldali femorális keringés hasonló 350-370 cm/sec körüli sebességet mutatott.

A graftok elkészítéséhez szükséges átlagos idő 15 perc (13-18 perc), míg az átlagos anasztomózis idő 17 perc (15-20 perc) volt.

Az átlagos átmérő növekedés (dilatáció) 2,15 mm (1,2-3mm) volt és nem láttunk aneurysma képződést. Minden graft életképes volt, nekrózist nem láttunk a hatodik hónap végén sem.

Az arterializálódás jelei is megjelentek a kivett graftokban, összehasonlítva az egy hónapos vizsgálat eredményeivel.

A szövettani vizsgálatok során, hematoxilin-eosin és fibrin fixációval, a következő eredményeket találtuk. A beültetés előtti rectus fascia ismert és jellegzetes kötőszöveti elemekből állt, a felszíni peritoneumot pedig ép mesothelsejt-réteg borította.

A natív artéria iliaca szövettani feldolgozását is elvégeztük, és ezt összehasonlítottuk a kivett RF graftok szerkezetével. A graftok falában nem lehetett látni az artériára jellemző rétegeket (adventitia, media, intima), de a kötőszöveti elemek közt életképes és aktív fibroblasztok, valamint simaizom elemek jelentek meg.

Neoangiogenesist láttunk minden graftban, a mikroér-densitás (micro-vessel-density) index értéke átlagosan 5/látótér volt. Az endothel sejtek megjelenését vWf faktor és CD 34 expressziós immunhisztokémiai módszerekkel igazoltuk és ezek a lumeni felszínt 100% -ban fedték. Egyetlen mesothelsejt szigetet sem láttunk (1 ábra a, b, c, d, e, f) .

1. ábra a: Fibrin-collagen festés (RF graft–lumen); b: Fibrin-collagen festés (RF graft-fal); c:

Hematoxylin-eosin (artéria iliaca ext.); d: Hematoxyin-eosin (RF graft); e: CD 34 (RF graft); f: vWf (RF graft)

a b

c d

e f

Az elektronmikroszkopos vizsgálat életképes simaizom filamentumokat igazolt a graftok falában és megjelentek az elasztikus rostok is a fibrotikus elemek mellett. A mitochondriumok szerkezete is intakt volt, hypoxiára jellemző károsodást nem láttunk.

Továbbá, a különböző festési módszerekkel nem lehetett olyan degenerativ folyamatot igazolni, amely a cyclosporin mellékhatásaként szóba jöhetne. Az átlagos cyclosporin szint 150 és 200 ng/ml körül változott.

A kevert-sejtes kultúrák szintén életképes elemeket igazoltak, a sejtek igen jó arányban megtapadtak és szaporodtak. A mélyfagyasztott sejt-kultúrák is életképesek maradtak. Ezek csak előzetes eredmények, de a jövőben tervezzük a sejtek (mesothel, endothel) széleskörű vizsgálatát is.

A hat hónap alatt levett vérmintákból (az operált és kontroll oldalon) mért vérgáz értékek normális oxigén/széndioxid arányt (átlagosan : pO2 126-177 Hgmm/ pCO2 44-59 Hgmm) igazoltak. Az esetleges oxidatív stressz jelenlétét igazoló MPO szint normális volt minden esetben, az adott végtag szöveti oxigenizációja megfelelt az élettani körülményeknek. Minden MPO enzim érték normális tartományban (<30 ng/ml) volt, 4 és 13 ng/ml között változott.

A harmadik sorozatban a vénás oldalt vizsgálva a 16 RF graft esetén minden esetben jó eredményeket kaptunk, nem volt thrombsosis, a Doppler keringés megfelelő áramlást mutatott. A szövettani eredmények tekintetében pedig azt láttuk, hogy már 3 hónap után a 6 hónapnál is látható endothel réteg borította a RF graftokat ^[179,180].

6.5 Gyógyszertoxicitás májtranszplantáció után, a hazai donor pool CYP enzim szűrésének eredményei

A P450 enzimaktivitás változatosságát mértük a magyar populációban. A különböző P450 enzimek maximális katalitikus aktivitását mértük a gyógyszer-metabolizmus tekintetében109 magyar (kaukázusi) donor májban, máj mikroszomális frakciókból. A különböző szubsztrátok kiválasztásást ismert módszerek alapján határoztuk meg. A 109 esetből a P450 enzimaktivitás változatossága igen nagy különbségeket mutatot a különbözö szubsztrátokon a 10 ill 100-szoros tartományban (2. táblázat).

2. táblázat

Bizonyos esetekben az aktivitás a gyengétől (PM), az igen magas értékig (EM) terjedt.

Az 1.ábra (A,B,C) mutatja a CYP2C9, CYP2C19 és a CYP2D6 aktivitásának eloszlását.

A májdonorok igen változó metabolikus aktivitást mutattak. Fenotipizálás után a 109 máj donorból PM gyakorsiága 0,92%, 5,5% és 8,3% voltak a CYP2C9, CYP2C19 és CYP2D6 csoportokban ^[181,182]. Ultragyors metabolizáló volt 5,5% -ban a CYP2D6 aktivitása (1C. ábra).

1 ábra

Partialis (split) májgraftok transzplantációja. Partiális májgraftot kaptak elsősorban gyermekek 1997 januárjától 2006 júliusáig 16 esetben (14 gyermekgyógyászati és két felnőtt betegnél) a SE Transzplantációs és Sebészeti Klinikan. A primer májbetegségek:

a veleszületett májfibrózist (nyolc betegnél), fulmináns májelégtelenség (öt betegnél), glikogenózis (egy beteg), primer sclerotizáló cholangitis (egy beteg) és primer biliaris cirrhosis (egy beteg). A férfi: nő arány 9: 7 volt. Az átlagos Child-Pugh A pontszám 9 volt (5 és 15 között). Az átlagos hideg ischaemiás idő 380 perc volt (340 és 615 perc) és az átlagos meleg ischaemiás idő 58 perc volt (30 és 110 perc között). Minden partiális májgraft jól funkcionált már műtét 1 héttel. Itt nem voltak érrendszeri szövődmények.

Egy esetben az epeutak szövődményeivel találkoztunk (6,2%). Vérzés miatti reoperatio három esetben (18,7%) volt. Egy gyermeknél sikeres retranszplantációt végeztünk epeuti szövődmények miatt. Akut kilökődést észleltünk és kezeltünk sikeresen szteroid lökés SHOT terápiával (1 g metil-prednizolon , 3-5 napig/nap) hét esetben (43,7%). Tíz beteg (62,5%) flukonazol alapú gombaellenes kezelést kapott 7-18 napig, a klinikai

képtől függően. A ciklosporin A terápiás tartományának mielőbbi beállítására törekedtünk. A fenti 16 partiális graftal transzplantáltak közül jelenleg 14 beteg van életben jó graft funkcióval. A mortalitás 12,5% volt (két beteg exitált fulmináns májelégtelenség alapbetegség miatt). A 3 hónapos és a aktuális beteg túlélési arány 87,5% volt. Két gyermekgyógyászati esetnél (12,5%) a HH-069 és a HH-074 májgraftokkal történtek a transzplantációk. Átültetést követően mindkét esetben 2 héttel az MTX után hirtelen enzimemelkedés indult.

Klinikai eredmények a HH-069 és a HH-074 májgraft esetén:

A két gyermek, egy 12 éves lány kongenitális májfibrózissal és egy 16 éves lány, primer sclerotizáló cholangitisszel (PSC), a donor májakat splitteltük méretük miatt és a HH-069 és a HH-074 (azonosító kóddal) partiális graftokat ültettük át. A HH-HH-069 májdonor egy 18 éves nő, aki egy közlekedési balesetben halt meg, míg a HH-074 májnál egy 25 éves férfi volt, aki agyvérzésben halt meg. Mindkét átültetés technikailag szövődménymentes volt. Egy hét alatt normál máj- és vesefunkció mellett mindkét beteg osztályra került, de két héttel a transzplantáció után jelentős transzamináz, az alkalikus foszfatáz és bilirubin szint emelkedést észleltünk (2. ábra).

2. ábra A HH069 és HH074 májgraftok transzamináz változásai (GOT,GPT? GGT, ALP) és funkciói (bilirubin). A nyíl a gyógyszeres kezelés racionalizálását mutatja

A HH-069 graft biopsziája májnekrózist, zsíros degenerációt, eozinofil sejteket és apoptózist mutatott, amely felvetette gyóygyszer-toxicitás lehetőségét és kizárta a rejekciót vagy epeutifertőzést (3. ábra).

2. ábra saját HH-069 májgraft biopsziájának szövettani képe

Szerencsére mindkét májgraft esetén rendelkezésunkre állt a CYP enzim háttér vizsgálata. A HH-069 májban a CYP2C9, míg a HH-074 májban a CYP2C19 szubsztrátok bizonyultak poor metabolizereknek. A CYP3A4 aktivitás mindkét esetben jó volt (3. táblázat).

3. táblázat

Tekintettel a fenti redeményekre a gyógyszeres kezelés racionalizálására volt szükség.

Az omeprazolt, és a szulfametoxazoletrimetoprim és a flukonazolt leállítottuk, ugyanis ezek a gyógyszerek a fent említett PM esetekben rosszul metabolizálódnak. A pantoprazolt egyszerűen famotidinre váltottuk, az immunszuppressziót nem kellett változtatni. Minkét májgraft egy hét alatt normalizálódott és több éve azóta is jól működik (2 ábra).

6.6 A májszövet CYP enzim aktivitása és leukocytak génexpressziója