A proteinek detektálása

A detektálási módszer kiválasztását befolyásolják, az érdeklődésünkre számot tartó protein tulajdonságai, mennyisége, illetve a módszer érzékenysége, a festési módszer lineáris tartománya, és nem utolsósorban anyagi lehetőségeink, valamint a rendelkezésre álló képalkotó berendezés igényei.

A proteineket az aromás aminosavak (Trp, Tyr)UV elnyelése alapján festés nélkül is detektálhatnánk, de mivel a fehérjék extinkciós koefficiense kicsi, és a szennyeződések – a monomerek és az SDS – szintén elnyelnek, csak nagymennyiségű fehérje lenne detektálható nagyon tiszta reagensekből készített gélekben. Ezért a protein sávokat/foltokat festve, illetve egyéb jelölések után detektálják. A detektálási technika a jelölés módjától függ. A festett géleket szkennelhetjük vagy fényképezhetjük (abszorbancia alapján), a fluoreszkáló ágensekkel jelölt fehérjék fluoreszcens detektorral, a radioaktívan jelölt fehérjék pedig autoradiográfiával mutathatók ki.

A festés előtt a diffúzió megakadályozása céljából fixálni kell a proteineket és el kell távolítani azokat az anyagokat, amelyek zavarhatják a procedúrát (SDS, redukáló ágens, glicin, amfolit). Ionmentes vizet és üvegedényeket kell használni. Figyelembe kell venni, hogy a proteinek a különböző festési eljárásokkal különböző mértékben/intenzitással festődnek, tehát a proteinek minél teljesebb kimutatásához néha egymás után kétféle technikát is alkalmaznak.

Legáltalánosabb aCBB R250 és G250(vörös és zöld árnyalatú) festékek használata, mivel ezek a proteinek széles spektrumával reagálnak. (Régebben e festékeket a gyapjú festésére használták.) Savas/alkoholos közegben az -NH₃⁺ csoportokkal és hidrofób oldalláncokkal lépnek kölcsönhatásba. A savas közeg fixálja a proteineket és elősegíti a festékkötést. A festéktelenítés diffúzióval vagy a gél vastagsága irányában végzett elektroforézissel történhet. A CBB festékek abszorpciós maximuma 560-575 nm közt van, 40 ng protein a detektálhatóság határa.

Hátrányai, hogy erős a háttérfestődés, munkaigényes, DNS, lipopoliszaharidok és poliszaharidok is festődhetnek.

Akolloidális CBB G-250festéket alkalmazó procedúrákban a festés érzékenysége 10 ng, megközelíti az ezüst-festését (blue silver), és a háttérfestődés elhanyagolható.

Növényi fehérjék vizsgálata poliakrilamid gélelektroforézissel

Az ezüst-festés során Ag⁺ ionok (AgNO₃) savas közegben a proteinek töltött oldalláncaihoz kapcsolódnak, amelyeket azután a formaldehid lúgos pH-n Ag-té redukál (az oldat savanyításával leállítható). Az Ag fehérjékhez való kötődését oxidálószerek (K-permanganát/dikromát, ferricianid) elősegíthetik. 2D gélek esetében a második dimenzió festésénél gyakran használják. Vannak a módszernek színes változatai, amikor a különböző fehérjék különböző színűre festődnek.

Afluoreszcens jelöléslényege, hogy fluoreszkáló anyagot (danzil-klorid, fluoreszcein, MDPF – 2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)-furanon) kötnek kovalensen a proteinekre, ami UV megvilágítás hatására a látható tartományban fluoreszkál. Detektálása és a mennyiségi meghatározás azonban speciális műszert igényel, és a reagensek fluoreszcenciája hamar megszűnhet. Újabban új, fluoreszcens festékeket állítottak elő, amelyek stabil fluoreszcenciával rendelkeznek. Pl. aSYPRO Rubyérzékenysége 1-10 ng és széles koncentrációtartományban lineáris a fluoreszcens jel, nem festi a nukleinsavakat, de kimutatja a gliko- és lipoproteineket, kis MW-ú és fémkötő proteineket is, amelyek nem jól festődnek más festékekkel.

A láthatóvá tett proteinek mennyiségi kiértékeléséhez a géleket szkenneljük/fényképezzük és a sávok/foltok denzitását határozzuk meg (denzitogram). Erre a célra megfelel egy jó optikai felbontású szkenner, de speciális, kalibrálható, pixeldenzitást vagyfluoreszcenciát detektáló berendezések is kaphatók. A kiértékeléshezspeciális szoftverek vásárolhatók. A proteineket automata pipettavégekkel, illetve szofisztikált, erre a célra kifejlesztett berendezésekkel vághatjuk ki a gélekből (pontos foltkivágás, microplate-re helyezés).

Azautoradiográfiás detektálássorán radioaktívan jelölik a proteint, ami történhet a szintézis során, vagy radioaktív anyagokkal való kezeléssel, úgymint³H- vagy¹⁴C-danzill-klorid vagy¹⁴C-,³⁵S-fenilizocianát rákötésével,³ H-vagy¹⁴C-jódacetamiddal történő alkilálással,³H- vagy¹⁴C-formaldehiddel történő reduktív metilációval vagy a Tyr jodinációjával (¹²⁵I). A detektálás során a szárított gélt Röntgen-filmre helyezve a sugárzás hatására az AgCl-ból Ag válik ki, a feketedés fotózható, denzitometrálható. Ha oldható gélekkel dolgoztunk, a géleket szeletelés után feloldjuk, és szcintillációs számlálóval mérjük a radioaktivitást.

Glikozilált proteinek (glikoproteinek) kimutatására fukszin-alapú Schiff- (PAS-) festés a legelterjedtebb módszer, a legérzékenyebb módszerek közé azonban olyan kimutatások tartoznak, mint a timol-szulfáton, vagy az akár 40 ng szénhidrátot is kimutatni képes danzil-hidrazinon alapuló festés. A lektinek speciális, szénhidráthoz kötődő fehérjék. Izotóppal, fluoreszcens festékkel jelölt vagy enzim-konjugált lektinekkel ugyancsak detektálhatók a glikoproteinek a gélekben.

Foszforilált proteinekkimutatására nukleinsavaktól tökéletesen megtisztított minta esetében van lehetőség. A kimutatásra fel lehet használniin vivoizotóppal jelölt mintákat, hiszen a³²P a fehérjékbe csak foszforilációval épül be. A nem-radioaktív kimutatási technikák közül legérzékenyebb az alkalikus hidrolízissel szabaddá váló foszfátcsoport oldhatatlan kalcium-foszfáttá történő alakítása, és ammónium-molibdát és metilzöld festék segítségével történő kimutatása (foszfomolibdát képződik). A módszer kimutatási határa 1 nmol foszfát körül mozog.

Rodamin-β-foszfomolibdát kialakításával a kimutathatóság határa 2-3-szorosára növekszik.

Alipoproteinekdetektálása történhet elektroforézis utáni kimutatással (pl. Schiff-festés alapú módszerek), illetve futtatás előtti festési módszerekkel (pl.nitroblue tetrazólium: NBT, acetiláltSudan blackB), melyek ideális esetben nem, vagy csak kevéssé zavarják az elektroforézist.

Enzimekaktivitásfestése gélekben leggyakrabbanin situszínreakcióval történik (8.9. ábra). A módszerek szemi-kvantitatívak, és viszonylag kevés enzim festésére jól kidolgozottak. Használatukkal azonban lehetővé válik egy adott enzimreakciót mutató fehérjesáv kimutatása más fehérjék jelenlétében. Az enzimfehérjéket, aktivitásuk megőrzése érdekében, csak natív körülmények között választhatjuk el, ami csökkenti az elválasztás hatékonyságát, bár ismert néhány példa, pl. humán hasnyálmirigy enzimek közül, amikor az enzimek SDS-PAGE elválasztás után is jó enzimaktivitást produkálnak.

64

XML to PDF by RenderX XEP XSL-FO F ormatter, visit us at http://www.renderx.com/

8.9. ábra.Enzimfehérjék aktivitásának kimutatásain situaktivitásfestéssel. (A) A peroxidáz izoformák hidrogén-peroxid jelenlétében aromás monomereket oxidálnak színes végtermékké. (B) A szuperodid diszmutáz izoformák

hidrogén-peroxidot bontanak, így aktivitásuk helyén a gél nem színeződik el (negatív festés).

Redoxreakciókban tetrazólium sókat (NBT; metil-tiazolil-tetrazólium: MTT) lehet használni a kimutatáshoz, melyek végső elektron-akceptorként redukálódva színes végterméket eredményeznek. Peroxidáz enzimreakciók kinonos és benzidin jellegű szubsztrátokkal mutathatók ki (8.9.A és 8.10. ábra). Az enzimreakció gélben történő kimutatásához a szubsztrátnak be kell jutnia a gélbe, valamint a keletkező színes, vagy fluoreszcenciára képes terméknek nem, vagy csak kis mértékben szabad a gélben diffundálni. Minden enzimreakció pH optimummal rendelkezik, amelyet a gél megfelelő pH-jú pufferben történő inkubálásával tudunk elérni. Ritkán használt módszer a szubsztrátok poliakrilamid gélbe történő szilárdítása a gélelektroforézist megelőzően.

8.10. ábra.Peroxidáz enzimreakció kimutatása poliakrilamid gélben. A szubsztrátként felhasznált benzidin-vegyület a peroxidáz enzim aktivitása következtében hidrogén-peroxid jelenlétében polimerizál, majd egy következő

enzimatikus lépésben oxidatíve ciklizálódik, így oldhatatlan, gélben maradó színes végtermék keletkezik.

Növényi fehérjék vizsgálata poliakrilamid gélelektroforézissel