A kivonat ellenőrzése

Minden vizsgálatnál, amelyhez tisztított RNS-re van szükség, erősen ajánlott a kinyert RNS mennyiségének és minőségének ellenőrzése. Maga a kinyerés is idő- és költségigényes, de ez fokozottan igaz az RNS-t felhasználó alkalmazások többségére, így fontos ismerni a kivonat mennyiségi és minőségi jellemzőit. Az ellenőrző vizsgálatot rögtön az RNS kinyerése után el kell végezni, amennyiben pedig az RNS-t hosszabb (vagy akár rövidebb) ideig

RNS kinyerése növényekből

tároljuk, közvetlenül a felhasználás előtt szintén érdemes megvizsgálni, hiszen különösen érzékeny molekuláról van szó.

9.4.1. UV-spektrofotometria

A nukleinsavak mennyiségi meghatározásához leggyakrabban a 260 nm-en mért elnyelési értéket szokták figyelembe venni. Ez a legegyszerűbb, leggyorsabb és legelterjedtebb módszer a kitermelés, a tisztaság és a valószínű felhasználhatóság megállapítására. A tiszta nukleinsavak jellegzetes elnyelési profilt mutatnak 230 és 320 nm között (9.4. ábra). 320 nm-nél a tiszta nukleinsavmintának nincs már elnyelése. A normális görbétől való eltérés szennyezők jelenlétére utal, amelyeknek természetére a görbe módosulásának helyéből következtethetünk. Az elnyelés egyenesen arányos a minta RNS-tartalmával, amelynek ismerete elengedhetetlen pl. a helyes enzim : primer : RNS-templát arány beállításához, ami viszont a hatékony reverz transzkripció alapja. A nukleinsavak abszorpciós maximuma 260 nm-nél látható. Az elnyelés mértékéből a koncentráció a következő egyenlet alapján számítható:

μg RNS / ml = A₂₆₀× hígítás × 40 ahol

A₂₆₀= elnyelés (abszorpció, optikai denzitás) 260 nm-nél (OD₂₆₀) hígítás = a hígítás mértéke, pl. tízszeres hígításnál 10

40 = az RNS átlagos extinkciós koefficiense (40 μg / OD₂₆₀)

A pontos érték függ az RNS elsődleges és másodlagos szerkezetétől és a pH-tól, ill. közvetett módon az ezeket befolyásoló tényezőktől (ionerő, ionok típusa, EDTA, ill. denaturálószerek jelenléte, hőmérséklet). A kettős szálú DNS koncentrációja hasonlóan számolható (50 μg / OD₂₆₀), de mivel a timin és az uracil extinkciós koefficiense különbözik, a DNS-szennyezett RNS-oldat, ill. az RNS-szennyezett DNS-kivonat elnyeléséből helytelen adat számolható.

A 0,1 OD alatti elnyelés főként a régebbi típusú spektrofotométereken hamis eredményt adhat, így ha hígítás miatt lett ilyen kicsi a kivonat elnyelése, érdemes töményebb oldatot mérni. Gyakorlati probléma lehet az UV-spektroszkópia alkalmazása során a mérendő RNS kis mennyisége. Az elnyelés pontos meghatározásához – egy átlagos fotométer esetében – 5 μg/ml fölött kell lennie az RNS töménységének, ami a szokásos küvettákat használva min. 4 μg. Ez a mennyiség nem feltétlenül áll rendelkezésre, ilyenkor hasznos lehet a mikroküvetta, amellyel már 7 μl mintát is meg lehet mérni. Egy másik, modernebb lehetőség az ún. cseppfotométerek (pl. NanoDrop^TM) használata, amelyek nem küvettában, hanem két száloptika között kifeszített egyetlen cseppben mérik egy adott oldat elnyelési tulajdonságait. 0,5-3 μl minta elegendő a méréshez, ami nem elhanyagolható előny egy 20-60 μl végtérfogatú nukleinsav-kivonat esetén. A készülék a mérés után a 220 és 350 nm közötti spektrumot is kirajzolja, ill. a helyes beállítás mellett ng/μl (= μg/ml) mértékegységgel azonnal kijelzi a minta RNS-tartalmát is (9.4. ábra).

86

XML to PDF by RenderX XEP XSL-FO F ormatter, visit us at http://www.renderx.com/

9.4. ábra. Növényi RNS-kivonat UV-spektrofotometriai vizsgálata NanoDrop fotométerrel. A: az elnyelési spektrum 220 és 350 nm között és az elnyelési alapadatok; B: táblázatos riport a készülék programjából a fenti adatokkal.

A mennyiségi meghatározást leginkább a szennyező anyagok nehezítik. Ezek tipikus példái a fehérjék, fenoloidok és kisebb mennyiségben a kinyerés egyes reagensei, mint pl. a 2-merkaptoetanol vagy a DTT.

Az A₂₆₀érték azonban önmagában nem sokat mond a minta minőségéről és tisztaságáról, ezért az A₂₆₀/A₂₈₀ ésA₂₆₀/A₂₃₀(és esetlegA₂₆₀/A₂₄₀) arányokat is érdemes figyelembe venni (9.3. táblázat). A tiszta RNS-kivonat A₂₆₀/A₂₈₀ értéke 2,0 ± 0,1, míg az A₂₆₀/A₂₃₀ arány 2,0 és 2,4 között van. Az alacsony A₂₆₀/A₂₈₀ érték fehérjeszennyezésre utal, míg az 1,5-1,8 alatti A₂₆₀/A₂₃₀arány eredhet guanidinium, merkaptoetanol, vagy egyes sók, ill. speciálisan a növényi mintáknál poliszacharidok jelenlétéből. Az A₂₆₀/A₂₄₀arány 1,4 alatti értéke azt jelezheti, hogy nagyobb mennyiségű só maradt a kivonatban. Ilyenkor érdemes újra kicsapni az RNS-t az oldatból, majd többszöri etanolos mosás után szárítani és újra feloldani a csapadékot.

9.3. táblázat. A nukleinsav-kivonatok tisztaságának ellenőrzése az UV-elnyelés alapján: a helyes és a problémára utaló arányértékek

Szennyezettségre utaló arány és a szennyezés típusa RNS

DNS

Az 1,8 alatti arány fehérjeszennyezésre utal 2,0

1,8 A₂₆₀/A₂₈₀

Az 1,8 alatti arány poliszacharidok, vagy detergens jelenlétére utal 2,0 – 2,4

2,0 – 2,4 A₂₆₀/A₂₃₀

Az 1,4 alatti arány sószennyezésre utal 1,4 – 2,0

1,4 – 2,0 A₂₆₀/A₂₄₀

9.4.2. Agaróz gélelektroforézis

A kinyert RNS agaróz, vagy poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálható. Ha denaturáló körülmények szükségesek, formaldehidet adnak az agaróz, ill. ureát a poliakrilamid gélhez.

RNS kinyerése növényekből

Az RNS integritását, sértetlenségét legegyszerűbben agaróz gélelektroforézis módszerrel ellenőrizhetjük. 1-1,2%-os, denaturáló agaróz gélen futtatva a kivonat néhány μl-es mennyiségét, az rRNS sávok és a háttér tisztasága alapján becsülhető a kinyert RNS épsége. Az elmosódott sávok és a hosszan elnyúló háttérzaj („smear”) az RNS bomlására utal. A teljes bomláskor a sávok eltűnnek és csak nagyon alacsony molekulatömegű „smear” figyelhető meg a gélen. Denaturáló körülmények között az RNS minőségét jól jellemzi a 25-28S és a 18S rRNS sávok aránya:

mivel előbbi molekula durván kétszer akkora, mint az utóbbi, így a festék (pl. etidium-bromid) intenzitása is kb.

kétszerese a magasabban levő sávban, ha az RNS sértetlen állapotban van.

Növényi mintáknál a sejtmagban kódolt (sm) rRNS csíkok között és alatt megjelennek a kloroplasztisz rRNS-ek – és esetenként mRNS-ek – is, de a sávok sorrendje növényfajtól és a szövet típusától függően változhat (9.5.

ábra).

9.5. ábra. Növényi RNS-kivonatok elválasztása agaróz gélen. A sejtmagban kódolt (sm) 26S és 18S rRNS-ek mellett megjelennek a kloroplasztiszban kódolt rRNS és mRNS molekulák sávjai is.

A hagyományos módszer modern alternatívája a mikrofolyadék technológia, amely során az elektroforézis miniatürizált formában megy végbe egy apró üveglap („labchip”) felületén. A módszer előnye a nagyobb érzékenység, a minimális mintafogyás és a nagy felbontás. Az eredmény a hagyományos gélszerű kép mellett elektroferogram formájában is megjeleníthető és sokkal pontosabb vizsgálatot tesz lehetővé.

A kisebb RNS-molekulákat denaturáló (7 M urea) poliakrilamid gélen szokták vizsgálni. Ez a módszer (a berendezéstől függően, ill. kb. 150 nu méret alatt) elvileg alkalmasegyetlennukleotid méretkülönbség feloldására is. Az RNS-gél festésére általában etidium-bromidot használnak, amely UV-megvilágítás (~300 nm) hatására narancs-vörös színben fluoreszkál (~600 nm). Fluoreszcenciája nukleinsavhoz kötve erősen nő, így a háttértől többnyire kimosás nélkül is jól megkülönböztethető.

9.4.3. Egyéb ellenőrzési lehetőségek

Az UV-spektroszkópia egyik alternatívája a fluorometriai vizsgálat, amikor az RNS-hez fluoreszkáló anyagot kötnek. Ilyen pl. a RiboGreen (Life Technologies), amelynek fluoreszcenciája a kötődés után 480 nm-en gerjesztve 520 nm-en mérhető és 1-1000 pg/μl tartományban alkalmazható. A RiboGreen előnye a spektroszkópiával szemben, hogy specifikus az RNS-re, míg utóbbit a DNS-szennyezés zavarja. A RiboGreen emissziója alapján egy standard hígítási sor ismeretében számolható a minta RNS-tartalma.

88

XML to PDF by RenderX XEP XSL-FO F ormatter, visit us at http://www.renderx.com/

A PCR tulajdonképpen a minőség ellenőrzésének végső lépése is lehet: ha jó minőségű RNS-kivonaton mindig biztosan működő primerekkel (pozitív kontroll) sem sikerül terméket produkálni az új kivonattal, az biztos jele az adott minta degradációjának, vagy legalábbis használhatatlanságának.