A mutációk kimutatásához két alapvető megközelítést használhatunk: vagy közvetlenül (pl. szekvenálással) mutatjuk ki az elváltozást, vagy ismertmarkereksegítségével közvetett kimutatást alkalmazunk. Egy mutáció legbiztosabb, ám költséges kimutatása a szekvenálás. Ha gazdaságosabb módszert, vagy előzetes eredményt szeretnénk, akkor az ismert markerek kimutatására irányuló teszteket kell végeznünk. Markernek hívjuk a genom azon pontjait, amelyeket valamilyen módon azonosítani tudunk. Ilyen ismert markerek lehetnek a genom térképezési pontjai, vagyis azSTS-ek (Sequence Tagged Site, azaz szekvenciával megjelölt helyek), melyeket általábanPCR(Polimerase Chain Reaction, polimeráz láncreakció) segítségével mutathatók ki. Az STS egy viszonylag rövid (200-500 bázispár hosszú), ismert lokalizációval és bázissorrenddel rendelkező szakasz, amely a genomban csak egyszer fordul elő.
Markerként használhatók azEST-k (Expressed Sequence Tag, jelölt átíródott szekvencia) is, melyek cDNS klón segítségével meghatározott részszekvenciák. Az EST-k egy adott mRNS jelenlétéről, egy gén működéséről, egy fehérjekódoló DNS szakaszról adhatnak információt. Ezek mellett számos egyéb marker típus létezik, közéjük sorolhatjuk pl. a különböző hosszúságú mikroszatellitákat is. Ahhoz, hogy a markerek segítségével genetikai elváltozásokat kutassunk, nem feltétlenül kell ismernünk magát az esetleg mutációt szenvedett gént vagy a hatásmechanizmusát. Ha egy betegség kapcsán felmerül a genetikai mutáció gyanúja, akkor különböző molekuláris technikákkal győződhetünk meg arról, hogy mely génben és milyen mutáció történt.
Egy genetikai betegség kimutatásához a következő lépéseken célszerű végigmenni:bioinformatikai rész: a vonatkozó szakirodalom feldolgozása, az érintett gén és a konkrét mutáció azonosítása, a megfelelő teszt kiválasztása;
laboratóriumi teszt: a kimutatás végrehajtása, minőség-ellenőrzés. A továbbiakban a konkrét kimutatási technikákról lesz szó.
RFLP
AzRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, restrikciós fragment hossz polimorfizmus) a hagyományos mutáció kimutató technikák közé tartozik. Lényege, hogy avad típusúés azismeretlenDNS-t emésztik egy (vagy több) restrikciós endonukleáz enzimmel. A restrikciós endonukleázok a bakteriális „immunrendszer” részét képezik, és bizonyos 4-8 bázispár hosszúságú, palindrom11szekvenciájú DNS szakaszokat nagy pontossággal ismernek fel és hasítanak el. Ezeken a szakaszokon a DNS mindkét láncát hasítják. A baktériumokban betöltött biológiai szerepük a sejtidegen DNS (például a baktériumot megtámadó bakteriofág DNS-e) felismerése és megsemmisítése.
Felfedezésük (W. Arber, H. Smith és D. Nathans: 1978-as Nobel-díj) tette lehetővé a géntechnológia megszületését.
Az egyes restrikciós enzimek felismerő (és hasító) specifitása különbözik, vagyis más-más szekvenciájú DNS szakaszokat ismernek fel. Több száz különböző baktériumokból származó és kereskedelmi forgalomban is kapható restrikciós enzim létezik, melyek felhasználása messze túlmutat az RFLP eljáráson, például a génsebészet nélkülözhetetlen kellékei.
Az RFLP-vel történő mutáció-kimutatás akkor alkalmazható, ha a mutáció egy restrikciós endonukleáz hasítóhelyén van, ebben az esetben az adott enzim a mutáció helyén nem képes hasítani. Emiatt – a vad típushoz képest – megváltoznak a fragment-hosszak, ami jól látszik az emésztő enzimes kezelés után elvégzett gélelektroforézisen.
A módszer tehát olyan SNP-k, inzerciók, deléciók kimutatására alkalmas, melyek érintik az alkalmazott restrikciós enzimek hasítási helyeit. Az RFLP hátrányai közé tartozik, hogy a kis fragmentek elválasztása miatt radioaktív jelölést kell alkalmazni, ami rákkeltő hatású, valamint, hogy csak akkor használhatjuk, ha ismerjük a szekvenciát és mutációt.
AzEcoRInevű,Escherichia coliból kivont restrikciós enzim a kettős szálú DNS-t minden olyan ponton hasítja, ahol a 5'-GAATTC-3' szekvencia (nem metilált formában) előfordul. Az5. ábránegy olyan mutáció RFLP-vel történő kimutatása látható, ahol az EcoRI második hasítóhelyén történt egy pontmutáció, ezáltal az enzim itt nem képes hasítani, így két rövidebb helyett egy hosszabb szakaszt mutat a gélelektroforézis.
7.5. ábra: RFLP: a) A vad típusú DNS lánc (DNS 1), három EcoRI hasítóhellyel, és a második EcoRI hasítóhelyen mutációt szenvedett DNS lánc (DNS 2). b) A két DNS lánc EcoRI-es emésztés utáni gélelektroforézisének
eredménye.12
PCR
APCR(Polymerase Chain Reaction, polimeráz láncreakció) (Kary Mullis és Michael Smith, 1993-as Nobel díj) egy olyan molekuláris biológiai technológia, melynek célja egy előre definiált (target) DNS szakasz enzimatikus
11Olyan szó vagy mondatrészlet, amely visszafelé olvasva is ugyanaz, pl: „Géza, kék az ég”. Egy DNS szakasz akkor palindrom, ha a komplementer szálat olvasva is ugyanazt kapjuk.
12Az eredeti kép forrása: National Biological Information Infrastructure
amplifikációja (sokszorozása). A target DNS szakasz általában nem hosszabb 10 000 bázisnál, lehet egy gén, génrészlet vagy nem kódoló régió is.
A PCR reakció-elegybe a következők kellenek: templát DNS (pl. egy sejt maganyaga), nagy feleslegben primerek, Taq polimeráz enzim, dNTP mix és puffer-oldat. Atemplát DNStartalmazza a sokszorozni kívánttargetszakaszt.
A kétprimerolyan rövid DNS lánc, amely meghatározza a target DNS szakaszt, ugyanis a primerek szekvenciája azonos a sokszorozni kívánt DNS szakasz elejével (5' vég) és végével (3' vég). Feladatuk, hogy specifikusan hozzákötődjenek az egyszálú DNS megfelelő szakaszához – így ezen a szakaszon ismét kétszálú lesz a nukleotidlánc –, ami elengedhetetlen a Taq DNS-polimeráz enzim bekötődéséhez, vagyis a komplementer DNS szál felépüléséhez.
ATaq DNS-polimerázegy hőstabil enzim, melyet a hőforrásokban élőThermus aquaticusbaktériumból vontak ki, feladata a DNS másolása magas hőmérsékleten. AdNTP(dezoxiribonukleid trifoszfát)mixaz új DNS szálak felépítéséhez szükséges ATP-t, TTP-t, GTP-t és CTP-t tartalmazza. A DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet apuffer-oldatbiztosítja.
A reakció egyPCR készülékbenzajlik, amely biztosítja a PCR folyamathoz szükséges változó hőmérsékleteket.
Ugyanis a PCR reakció úgy zajlik, hogy a reakció-elegyet a készülék először 94-96°C-ra felmelegíti, ekkor a templát DNS-ek egyszálúsodnak, vagyis a hidrogénhidak felbomlása általdenaturálódnak. Ezután az elegyet a készülék 45-60°C-ra hűti, hogy a primerek hozzá tudjanak kapcsolódni a nekik megfelelő target DNS szálakhoz.
A kapcsolódási hőmérséklet a primerek szekvenciájától függ és általában 5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt. Ezt a lépéstanellálásnakvagy kapcsolódási lépésnek nevezzük. Ha a hőmérséklet túl magas, a primerek nem kötődnek a templáthoz, ha túl alacsony, akkor a nem specifikus helyekre is bekötődnek, esetleg fals termékeket hozva létre. Ezek után újra emeli a hőmérsékletet, 72°C-ra. Ezen a hőfokon kezdi szintetizálni a templát DNS komplementer szálait a Taq polimeráz. A szintézis a kapcsolódott primernél kezdődik, és végigmegy a DNS-szálon. A lépés nevemeghosszabbítás, ami a szintetizálás alatt álló DNS meghosszabbítására utal. A szintetizálás során a szülő nukleinsavszál templátként szolgál a leány lánc létrehozásához. A leány szál egy perc alatt kb. 1000 bázissal hosszabbodik. Ezután a készülék újra 96°C-ra melegíti az elegyet és a ciklus kezdődik elölről (7.6. ábra). Egy-egy ciklus pár percig tart. A legelső kör előtt a DNS-t általában hosszabb ideig denaturálják, hogy a templát DNS és a primerek esetleges kettős szálai is teljesen szétváljanak. Elméletileg minden ciklusban megduplázódik a target DNS molekulák száma. 25-30 ismétléssel már megfelelő mennyiségű, gélelekrtoforézissel is kimutatható DNS képződik. A PCR reakció annyira érzékeny, hogy extrém esetben akár egyetlen DNS molekulát is meg lehet sokszorozni vele. Ha egyetlen DNS szálból indulunk ki és 25-ször ismételjük a reakciót, akkor a végén 225, azaz 33 554 432, vagyis kb. 3,36×107darab target DNS-ünk lesz. A PCR-termékek gélelektroforézis segítségével a méretük alapján azonosíthatóak. A termék mérete egy, szintén a gélbe injektált, ismert hosszúságú DNS-szakaszokat tartalmazóDNS-létrávalösszehasonlítva határozható meg.
A PCR reakció menetének összefoglalása:
1. T↑,denaturálás: egyszálúsodnak a DNS-ek
2. T↓,anellálás: a primerek hozzákapcsolódnak a target szakaszokhoz 3. T↑,meghosszabbítás: a Taq polimeráz szintetizálja a komplementer szálat 4. vissza az 1. pontra (25-30 ismétlés)
7.6. ábra: A hagyományos PCR reakció menete13