A gyakorlat első felében aC. elegansmutáns törzsekkel fogunk megismerkedni (15. és 16. ábrák). A vad típusú állatot hasonlítjuk össze több féle mutáns fenotípussal. A kapott Petri csészéken megtaláljuk a vizsgálandó mutáns törzsek nevének hárombetűs rövidítését. Először a vad típust (wild-type, WT vagy N2) vizsgáljuk meg. Ennek az állatnak a fenotípusa, genotípusa megegyezik az eredetileg izoláltC. elegans-éval. A lemezen a legnagyobb állatok, a felnőttek formáját, mozgását próbáljuk megfigyelni. Általában a fejük irányában haladnak, színuszoid (S-alakú) mozgással. A testükben kivehetőek az embriók. Az állatok körül lerakott embriók, valamint kisebb méretű, mozgékony lárvákat láthatunk (4.14. ábra, középső panel).
A gyakorlatin vizsgált morfológiai mutáns törzsek:
him-8: Him (High incidence of males) fenotípus. Egy kromoszóma-szétválási rendellenesség következtében magas százalékban jelennek meg XO kariotípusú hím egyedek. A hímek karcsúbbak és mozgékonyabbak. Figyeljük meg a hímek farkán a zászló nevű párzó képletet!
lon-2: Lon (Long), hosszú testméret fenotípus. Az állatok megnyúlt testhossza a sejtek méretének túlzott növekedése következtében alakul ki.
sma-6: Sma (Small) kicsi testméret fenotípus. A Lon mutánssal ellentétes fenotípus, kicsi sejtméret eredménye.
dpy-6: Dumpy (Dpy) tömzsi fenotípus. Ezek az állatok rövid és vastag testtel rendelkeznek.
rol-6: Rol (Roller) fenotípus. Az állatok bőrizomtömlője spirál irányban megcsavarodik a test mentén, ettől mozgás közben pörög az állat a hosszanti testtengely mentén. Domináns mutáció, ezért a mutáns allélt kotranszformációs markerként is használják.
unc-2: Unc (Uncoordinated) fenotípus. Mozgásképtelen (béna, paralizált) állatok, az átlagosnál rövidebbek.
lin-28: Pvl (Prodruded vulva) fenotípus. A hermafroditák vulva szövete kifordul (kitüremkedik) a test ventrális síkjából.
unc-14; dpy-6: Kettős mutáns. Mivel a két gén működése független egymástól, a kettős mutáns mindkét törzs fenotípusát mutatja, azaz Unc és Dpy fenotípusú egyszerre.
let-60(gf): Muv (Multivulva) fenotípus. Domináns mutáció, a hermafrodita állatok ventrális testfalán több vulvakitüremkedés látható.
lin-39: Vul (Vulvaless) fenotípus. A hermafrodita állatokban nem fejlődik vulva szövet. Emiatt az utódok nem tudják elhagyni a mama ivarszervét, az anyában kelnek ki és kezdenek el fejlődni. Ez az anya pusztulásához vezet, amelyet bag-of-worms– egy zsáknyi féreg – fenotípusnak is nevezünk. A Vul mutáns törzsek nem raknak le embriókat az agar felszínére.
4.15. ábra. A gyakorlaton előforduló C. elegans mutáns fenotípusok. WT (wild-type – vad típus): vad típus;
Lon (Long – hosszú): hosszú testméretű mutáns állat; Dpy: rövid, „köpcös’” testalakú állat; Unc: béna, paralizált állat, amely nem képese mozogni; Rol (Roller - gördülő): körbe-körbe mozgó állat; Pvl (Protruded
vulva): kitüremkedő vulva fenotípusú állat; Muv (Multivulva): több vulvaszövetet tartalmazó állat; Vul (Vulvaless): vulva szövetet nem fejlesztő állat. A fenotípusok részletesebb leírása a szövegben megtalálható.
4.16. ábra. Egy unc-14; dpy-6 kettős mutáns állat. Az állat egyszerre tömzsi, rövid és nem képes mozogni (béna, paralizált). A mendeli szegregáció az F2 nemzedékben 9:3:3:1 hasadási arányt mutat. Az „1” kategória
a kettős mutánsok arányát mutatja, amelyek fenotípusa: Unc, Dpy.
II. A Ras jelátviteli útvonal vizsgálata
A gyakorlat második felében a vulva szövet kifejlődésében szerepet játszó Ras jelátviteli útvonal mutánsaival fogjuk az episztázis analízist gyakorolni. A Ras (RTK/Ras/MAPK, Receptor Tirozin Kináz/Ras/Mitogén Aktivált Protein Kináz) jelátviteli kaszkád egy tipikus genetikai útvonal, amelynek központi szerepe van a vulva szövet kialakításában (4.17. ábra). Az útvonal egy ligandum (EGF,epidermal growth factor- epidermális növekedési faktor) szekretálásával „kezdődik”, amely egy konzervélt RTK receptort aktivál. A receptor aztán egy sor citoplazmás átvivő molekula (kinázok) aktivációját eredményezi, amelyek végül egy olyan transzkripciós faktort szabályoznak, amely a vulva kifejlődéséhez szükséges célgének aktivitását határozza meg. Az útvonal normális működése teszi lehetővé a vulva indukcióját az L3 lárvastádium elején. Addig a stádiumig az állat középső része egy „zárt cső”.
A vulva szövet kialakulásával egy nyílás (vulva) képződik az állat ventrális részén, amelyen keresztül az embriók elhagyják a hermafrodita ivarkészülékét, illetve a hím spermái a hermafroditába jutnak párosodáskor. A Ras útvonal hiperaktiválódása több vulva kifejlődését (Muv –Multivulva– fenotípus), csökkent működése a vulva indukció elmaradását (Vul –Vulvaless – fenotípus) eredményezi. Ezek az egyszeres mutánsok könnyen felismerhetőek sztereómikroszkóp segítségével. A Vul és Muv fenotípusú egyszeres mutánsok keresztezésével kettős mutánsok állíthatók elő. Világos, hogy egy ilyen kettős mutáns nem lehet egyszerre Vul és Muv is, valamelyik egyszeres mutáns fenotípusa nyilvánul meg a kettős mutánsban (vagy Vul vagy Muv lesz a kettős mutáns fenotípusa). Ez azt mutatja, hogy a mutáns allélek által kijelölt gének nem függetlenül öröklődnek egymástól (nem a mendeli 9:3:3:1 hasadási arányt mutatják az F2 nemzedékben, ahol az 1 a kettős mutánsok aránya), hanem genetikai interakciót mutatnak. Érdemes megjegyezni, hogy a Ras útvonal számos egyedfejlődési lépést szabályoz. A Ras útvonalban deficiens mutáns állatok fenotípusa ezért pleiotróp. Az útvonal teljes hiánya korai lárva életképtelenséget okozhat, de számos más szerv és szövettípus kialakulásáért felelős.
4.17. ábra. A Ras útvonal komponensei C. elegans-ban. A Ras jelátvitelt a szomatikus gonád egyik speciális sejtje, az un. horgonysejt (anchor cell, AC) generálja. Az AC szekretálja a LIN-3 (lineage defective-3; hiányában
nem alakul ki a vulva szövet sejtvonala) növekedési faktort, amely egy EGF (epidermális növekedési faktor) ligandum. A LIN-3 (piros kör) a vulva elősejtek membránjában (rózsaszín vonal) található LET-23 RTK receptorhoz
(sárga vonal) kapcsolódik, azt dimerizálja (aktiválja). Az aktivált receptor aztán foszforiláció (P) révén egy sor citoplazmás jelátvivő molekulát aktivál (zöld és kék színnel jelölve), amelyek végül a LIN-1 transzkripciós faktort szabályozzák. Ha a LIN-1 aktiválódik, bejut a sejtmagba és ott a vulva kifejlődéshez szükséges gének expresszióját határozza meg. A nyilak aktivációt, a talpas nyilak gátlást jelölnek. lof:loss-of-function(funkcióvesztéses mutáció);
GOF:gain-of-function(funkciónyeréses mutáció); Vul: Vulvaless (vulva nélküli) fenotípus; Muv: Multivulva (több vulva) fenotípus.