A Hsp90 oligomerizációja, avagy kölcsönhatások önmagával

deléciója hátráltatja az élesztő sejtek növekedését, amit Cpr6 túltermelés sem ellensúlyoz. A biológiai hatást a PPI domént nélkülöző TPR-domén is kiváltja (Dolinski és mtsai, 1998;

Marsh és mtsai, 1998). A Hsp90 komplexek két egymást kizáró TPR-fehérjéjének kötését Prodromou és mtsai (1999) élesztőn vizsgálták, és azt tapasztalták, hogy a Sti1 és a Cpr6 azonos affinitású, de hatásuk számos tekintetben ellentétes egymással. A Sti1 dimer, a Cpr6 monomer (ami magyarázza egymás kölcsönös kiszorítását). A Sti1 fehérje kisebb affinitással köt az N-terminálist nem tartalmazó Hsp90 mutánshoz, a Cpr6 kötését ez nem befolyásolja. A Sti1 kötése az N-terminális konformációját megváltoztatja, meggátolja az ATP kötését és hidrolízisét, a Cpr6-é nem. Feltehetően az eltérő tulajdonságok teszik képessé a két fehérjét, hogy a Hsp90 chaperon ciklusának különböző fázisaiban asszisztáljanak.

Schnaider Tamás kísérletei nyomán elképzelhető, hogy a Hsp90 vagy direktben, vagy egy fehérje komplex részeként képes nukleinsavak kötésére (ld. Schnaider, 2000). A kötés az LKVIRK antitesttel gátolható volt, ami a középső (g-foszfát-kötő) régió részvételére utalhat. A DNS-kötés jelentősége ismeretlen, a Hsp90 ATP-kötését nem befolyásolja (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények).

1996; Nemoto és mtsai, 2001/b). A hő-indukált oligomerizációt divalens kationok, molibdát és vanadát, illetve denaturált szubsztrátfehérje potencírozzák (Jakob és mtsai, 1995/b; Garnier és mtsai, 1998; Chadli és mtsai, 1999; Nemoto és mtsai, 2001/b), geldanamycin és ATP gátolja (Chadli és mtsai, 1999). Érdemes megjegyezni, hogy a szerzők nem használtak ATP-regenerációs rendszert, és a kísérlet időtartama alatt képződött ADP kiszoríthatta az ATP-t az N-terminális kötőhelyről. ATP gátolja a divalens kationnal kiváltott oligomerizációt/aggregációt is (Garnier és mtsai, 2002).

2.7.3.2. Az oligomerizáció szerkezeti alapjai

Az oligomerizáció összefüggésben állhat a (C-terminális) hidrofób régió fokozott expozíciójával (Yamamoto és mtsai, 1991; Grenert és mtsai, 1999). Ugyanakkor differenciált pásztázó kalorimetriás (DSC) kísérletek arra engednek következteteni, hogy az oligomerizációs hőmérséklet egybeesik az N-terminális domén olvadáspontjával (Garnier és mtsai, 1998). Kis Hsp90 koncentrációnal az N-terminális domének intramolekulárisan (a dimeren belül) kapcsolódnak össze, nagy koncentrációnál illetőleg in vivo pedig vagy intermolekulárisan, vagy szubsztrát fehérjékkel tehetik ugyanezt (Maruya és mtsai, 1999). A specifikus ligandumok (nukleotid, geldanamycin) stabilizálhatják az N-terminális domént, ezért képesek gátolni az oligomerizációt. Elképzelhető, hogy először az N-terminális domén és a középső domén közötti kölcsönhatás szakad fel (Nemoto és mtsai, 2001/a, Tanaka és mtsai, 2001), amely destabilizálja az N-terminális domént. E mellett szól az is, hogy a feltételezhető C-terminális ligandumok (molibdát, vanadát, a-peptid) elősegítik az oligomerizációt.

A divalens kationok mind az N- mind a C-terminális domén aggregációját elősegítik. A magnézium-indukálta oligomerizációt az N-terminális geldanamycin/ATP nem védi ki, a C-terminálison kötött ATP viszont gátolja (Garnier és mtsai, 2002). Tehát az oligomerizáció a Hsp90 mindkét doménjének jellemzője, és csakúgy, mint a Hsp90 egyéb tulajdonságaiban, itt is a két domén rendkívül bonyolult kommunikációja határozza meg az eredő választ. Az oligomerizáció a Hsp90 egyéb tulajdonságait, így az ATP-kötést és a chaperon aktivitást szabályozhatja.

2.7.3.3. A Hsp90 elektronmikroszkópos képe – ahogy én láttam

1996-ban a baseli Biozentrumban, Ueli Aebi professzor laboratóriumában jártam. Az együttműködés célja az volt, hogy molekuláris elektronmikroszkópia segítségével tanulmányozzuk az ATP Hsp90-re gyakorolt hatását. Ekkor már régóta ismert volt Ichiro

Yahara munkacsoportjának a Hsp90 és a Grp94 alacsonyszögű árnyékolással (low-angle rotary shadowing) készített molekuláris elektronmikroszkópos „portréja” (Koyasu és mtsai, 1986).

Ennél a technikánál a fehérjét nagy töménységű glicerinoldatba helyezik, majd ráfújják egy csillámlemezre (glycerol spray). A lemezt ezután 6°-os szögben vákuumban forgatva platinával és szénnel árnyékolják, majd a készült profilt (replikát) átúsztatják egy elektronmikroszkópos rácsra. Az elektronmikroszkópos kép a nagy elektronszóró képességnek köszönhetően szép, kontrasztos, részletes, a világos háttéren a fehérje feketén tűnik fel..

Kísérleteink elején örömmel tapasztaltuk, hogy a 95%-os tisztaságú patkány máj Hsp90 (nagyrészt b) árnyékolt replikája a japán csoport által publikált struktúrát mutatja: trinoduláris, elongált alakú dimer (2.7.3.3.A ábra). A technikus javaslatára a mintákat megvizsgáltuk egy másik eljárással, negatív festéssel. Ennél a leképezési módnál a fehérje oldatot egy töltésmentesített (glow-discharged) rácsra visszük fel, egy-két percig inkubáljuk, majd a sót desztillált vízzel lemossuk, mert ez rontja a kép minőségét. Az uranil-formiátba mártott rácsot szobahőn szárítjuk, majd elektronmikroszkóppal vizsgáljuk, ahol a fehérje nem köti meg a nehézfémet, ezért a sötétebb háttéren világos (negatív) képet kapunk. Legnagyobb meglepetésünkre a negatív festéssel kapott kép alapvetően különbözött az árnyékolt replikától:

fánk alakú, alapjukkal összetapadó oligomer struktúrákat láttunk (2.7.3.3.B ábra).

A B

2.7.3.3. ábra A Hsp90 elektronmikroszkópos képe

A, glicerin-spray, alacsonyszögű forgatásos árnyékolás. A nyíl oligomert jelöl; B, negatív festés

Az ATP-hatás tanulmányozása helyett hozzáfogtunk a különbség okának szisztematikus felderítéséhez. Az alacsonyszögű árnyékolás előtt a mintát különféle módokon kezeltük (glicerin nélkül, puffert váltva, nem permetezve, hanem centrifugálva), és azt a következtetést vontuk le, hogy részben az alkalmazott alacsony fehérje koncentráció, részben a glicerin

(szerkezet stabilizáló) hatása következtében a Hsp90 oligomerek dimerekre disszociálnak (nem bemutatott adatok). Az is megfigyelhető volt, hogy a fánkszerű struktúra elvétve a replikákon is látható (ld. 2.7.3.3.A ábra, nyíl).

Míg az árnyékolásnál számtalan lépés segítheti elő a disszociációt, illetve a dimer forma szelektív adszorpcióját és leképezését, a negatív festésnél pont ellentétes a helyzet. Ezt a technikát egyébként is oligomer struktúrák megfigyelésére alkalmazzák, mert az alacsonyabb affinitású intermolekuláris kölcsönhatások jobban megőrződnek. Azonban az alacsony sókoncentráció, a hirtelen pH-változás műtermékek megjelenését, a csillámtól eltérő felszín eltérő adszorpciós képessége egy relatíve kis mennyiségben előforduló másféle speciesz feldúsulását eredményezheti. Ugyan a mintaelőkészítések során csak illékony pufferrel dogoztunk, mégis elképzelhető, hogy a glicerin-spray módszernél nem lemosott illékony puffer sókoncentrációja hatással van a Hsp90 elektronmikroszkópos képére. A Hsp104 oligomerziációja szintén erősen füg az ionerősségtől (Schirmer és mtsai, 1998; 2001). A pH 4,25-ös uranil-formiát helyett pH 6,9-es foszfowolframáttal festett minták kontrasztja gyengébb volt, de a kép minősége szintén nem változott, azaz nem egy pH-függő oligomerizációval álltunk szemben (nem bemutatott adatok).

2.7.3.4. A fánkok a natív Hsp90 homo-oligomerjei

A szelektív adszorpció révén elméletileg egy szennyező fehérje is megjelenhet oligomer Hsp90-ként. Ennek vizsgálatára a mintát az AC88 monoklonális, kereskedelmi forgalomból (StressGen, SPA-830) származó antitesttel inkubáltuk, amely csak a szabad Hsp90-et ismeri fel (Hartson és mtsai, 1999), így kizárható, hogy a felismert fehérje a Hsp90 hetero-oligomerje.

Az elektronmikroszkópos képen mind a dimer, mind az oligomer fehérjék anti-Hsp90 immunoreaktívnak bizonyultak (nem bemutatott adatok). További független bizonyítékkal szolgáltak azok a kísérletek, melyben az Ichiro Yahara laboratóriumából származó tisztított patkány Hsp90 és az E. coli-ban kifejezett humán Hsp90a elektronmikroszkópos képe megkülönböztethetetlen volt a mi fehérjénkétől – annak ellenére, hogy a gélképen ezüstfestéssel látott szennyeződés eltérő jellegű volt a három minta esetén (nem bemutatott adatok). A Hsp90 az izolálás kezdeti lépéseiben együtt tisztul több oligomer fehérjével, pl. a proteaszómával és PA28 nevű aktivátorával, illetve a p97 nevű vezikuláris fúzióban szerepet játszó (NSF-szerű) fehérjével (Montel és mtsai, 1999; Schnaider T., Sőti Cs., Csermely P, nem közölt megfigyelések). Ugyan az általunk alkalmazott tisztítási mód elválasztja a proteaszómát a Hsp90-től, 97 kDa körül pedig nincs szennyeződés (Schnaider T., Sőti Cs., Csermely P., nem

közölt eredmények), egyéb fehérje 1-2%-os jelenléte nem kizárható. Hogy végképp meggyőződjünk, nem valamilyen szennyező faktort vagy annak a Hsp90-re gyakorolt hatását látjuk, egy adag Hsp90-et HPLC-gélszűréssel a Pharmacia mikropreparatív SMART berendezésén megtisztítottunk. A Hsp90(b) az oszlopról a monomerre jellemzős retenciós idővel eluálódott (amit okozhatott a nagy nyomás és a hígulás), az elektronmikroszkóban a szokott fánkjainkat láttuk viszont, bár a fehérje egy része aggregátumokat képezett (nem bemutatott adat).

A B

C D E

2.7.3.4. ábra A Hsp90 specifikus oligomer struktúrája

HPLC-gélszűréssel tisztított Hsp90 speciális elektronmikroszkópos leképezése. A, negatív festés pozitívan töltött rácson. A nyíl az oldalukkal a rácshoz kötő molekulák mellett egy felülnézetből ábrázolódó molekulát jelöl; B, mosás, festés nélküli in situ árnyékolás a rácson; C, aB-krisztallin, D, GroEL, E, proteaszóma elektronmikroszkópos képe (negatív festés)

Lévén a mintában többé az ezüstfestés sem „látott” semmilyen szennyeződést, egyetlen lehetőség maradt: az oligomer forma szelektív adszorpciója eredményezi a fánkok feldúsulását. Ezt az eshetőséget az akkori körülmények között két módon vizsgálhattuk.

Először pozitívan töltött rácsra vittük fel a mintát. A fánkokat szintén viszontláttuk, de érdekes módon most az oldalukkal tapadtak a felülethez, ami arra utal, hogy az oligomerek oldala negatívan töltött (2.7.3.4.A ábra). A másik kísérletben a rácsra felvitt mintát egyéb beavatkozás nélkül in situ árnyékoltuk, így a szelektív adszorpción túl arról is felvilágosítást kaptunk, vajon nem az urán, mint nehézfém denaturálja ilyen érdekesen a Hsp90-et (chaperonoknál sosem lehet tudni!). Az elektronmikroszkópos képen ismét gyönyörű fánkok

jelentek meg (2.7.3.4.B ábra), nagyban megerősítve azt az elképzelésünket, hogy a Hsp90 natív negyedleges szerkezete oligomer. Bár a kéthetes kinttartózkodás elejét vette a kvantitatív háromdimenziós képrekonstrukciónak, a Hsp90 elektronmikroszkópos képét hasonló körülmények között más oligomer fehérjékről készített képekkel vetettük össze (2.7.3.4.C, D, E ábra). Világosan látszott, hogy a 90 kDa-os fehérje, a hetero-oligomer proteaszóma és a nem szimmetrikus aB-krisztallin struktúrája nem téveszthető össze. A GroEL szerkezet már kissé jobban emlékeztetett a mi fehérjénkére, de a mi fehérjénk nem mutatott hétszeres szimmetriát, nem feltétlenül két gyűrűből, hanem néha jóval többől állt össze, végül a mi mintánk ritkán adszorbeálódott az oldalánál, inkább felülnézetből láthattuk.

2.7.3.5. Az oligomerek vizsgálata egyéb módszerekkel

Kintlétem ideje alatt natív és keresztkötést követő SDS-gélen is tanulmányoztam a Hsp90 negyedleges szerkezetét, hogy független módszerrel győződjem meg eredményeink megbízhatóságáról. A natív gélen az addig itthon tapasztaltakkal egyetértésben mindig jelen voltak oktamerek, és olyan oligomerek, melyek nem hatoltak be az elválasztó gélbe, de nem aggregátumok voltak, mert a tömörítő gélen „átverekedték” magukat. Emellett az oligomer-dimer-monomer diszkrét csíkok között a gélen szinte mindig elmosódott, folytonos festődést tapasztaltunk, amely a fehérje elektroforézis közbeni disszociációjára utalt. A keresztkötés a kipróbált tízféle ágens természetétől, hatékonyságától, reaktivitásától (amin, szulfhidril, karboxil) és karjának hosszától függően eltérő és nem abszolút érvényű eredményeket adott, ahol rendszert nem sikerült felfedeznem.

Hazajövetelem után glutáraldehiddel ismert negyedleges szerkezetű fehérjéket (GroEL 14mer, albumin (monomer-dimer-trimer), piruvát kináz (tetramer) kötöttem keresztbe, és annál a glutáraldehid koncentrációnal és időnél, ahol megkaptam az ismert formákat, keresztkötöttem a Hsp90-et. Sajnos a különböző fehérjék eltérő körülmények között adták a jellemző negyedleges szerkezetet, így a Hsp90-ről a monomertől az oligomerig minden negyedleges szerkezeti variáns elmondható volna (nem bemutatott adatok). A kudarcot vallott keresztkötés után dr. Szilágyi László laboratóriumában FPLC-gélszűréssel próbálkoztunk. A Hsp90 az irodalmi adatoknak megfelelően elongált dimerként eluálódott (nem bemutatott adatok).

Nemoto és Sato (1998) tanulmánya ez idáig az egyetlen, mely szisztematikus kísérletsorozattal igazolta, hogy a Hsp90 in vivo és in vitro oligomert is képez, és az

oligomerizációért a C-terminális dimerizációs domén a felelős. A glicerin-grádiens centrifugálással vizsgált a izoforma citoszolban oligomer, dimer és monomer, tisztítva elsősorban dimer és oligomer formában ülepedett, a frakciókat natív gélen megfuttatva a dimer foma dominált. A b izoforma kizárólag oligomer formában ülepedett, natív gélen viszont minden frakcióban kizárólag monomert és dimert lehetett látni. A szerzők kétdimenziós natív gél elektroforézissel bizonyították, hogy az oligomerek és a dimerek az elektroforézis során disszociálnak. Natív géles kísérleteik egybevágnak a mieinkkel, ami azt sugallja, hogy a Hsp90 oligomer formában is előfordul, és hogy az oligomereket a dimerekénél jóval gyengébb kölcsönhatás tartja össze. A mi elektronmikroszkópos kísérleteink annyiban állítanak többet, hogy (1) a nemcsak a citoszolban, esetleg heterokomplexben található Hsp90, hanem a teljesen tiszta, biológiai aktivitását megtartott, tisztított fehérje is előfordul oligomer formában; illetve (2) a Hsp90 domináns negyedleges szerkezete feltehetően az oligomer forma.

Ezt az elméletet minden kétséget kizáróan igen nehéz bizonyítani. A Hsp90 ebben a tekintetben sem hazudtolja meg önmagát: alacsony affinitású, feltehetően koncentrációfüggő oligomerizációját olyan metodikával lehet bizonyítani, mely az oldatban létező aktuális viszonyok között teszi lehetővé a negyedleges szerkezet tanulmányozását. Szegény ember vízzel főz alapon megpróbáltam kimutatni, hogy a Hsp90 statikus fényszórása a monomer tesztfehérjékétől eltérően nem lineárisan növekszik a koncentráció emelésével, sikertelenül.

Megvizsgáltam, van-e disszociáció a fényszórás és a triptofán fluoreszcencia koncentráció függése között, és hogy 6 M urea jelenlétében kapott fényszórás hányad része a natív fehérje fényszórásának, ismét kecsegtető eredmény nélkül (nem bemutatott adatok).

Az elektronmikroszkópos vizsgálatokkal nem egybevágó eredmények magyarázatául kínálkozik, hogy statikus fényszórással nem tudunk abszolút molekulaméretet meghatározni.

Elképzelhető az is, hogy a vizsgált koncentráció-tartományban a Hsp90 már oligomer formában található. Végül nem szabad elhanyagolni a citoszol molekuláris zsúfoltságát (Ellis, 2001), mely az összes folyamatot alapjaiban változtatja meg, illetve a Hsp90 in vivo mg/ml-es koncentrációját. Ugyanezeket a körülményeket a fenti módszerekkel tovább vizsgálhatnám, döntő bizonyítékot sem a hipotézis megtartása, sem az elvetése mellett nem jelentene. Milyen kísérlettel/módszerrel tudnánk eredményeink létjogosultságáról meggyőződni? Jelen pillanatban igazán intelligens kísérlet hiányában csak azok a módszerek adhatnak választ, amelyekkel közvetlenül, oldatban, nagy felbontással vizsgálhatnánk a Hsp90 oligomerizációját. Elméletileg szóba jön az egyensúlyi analitikai ultracentrifugálás és az

alacsonyszögű röntgen/neutronszórás. Tudomásom szerint Magyarországon egyik sem elérhető, és mindkét módszer hátránya, hogy vagy a részecskék eloszlását (heterogenitását), vagy az alakját modellek segítségével közelítik, melyek igen nagy tévedéséket eredményezhetnek. Alternatív módszer a mágneses magrezonancia spektroszkópia segítségével meghatározható diffúziós koefficiens, hasonló korlátokkal, nagy fehérjeigénnyel.

Amennyiben a teljes Hsp90 molekulát vagy annak középső C-terminális doménjét sikerülne kristályosítanunk, egyéb kérdéseinkre (is) választ kapnánk, de nem kell messzire menni, az élesztő Hsp90 N-terminális doménje (Prodromou és mtsai, 1997/a vs. Scheibel és mtsai, 1999/a) és a p23 fehérje (Weaver és mtsai, 2000) negyedleges szerkezetének kristály- és oldatszerkezete ellentmondásos. A legcélravezetőbb közvetlen képalkotó eljárás, a krio-elektronmikroszkópia segítségével véglegesen pontot tehetnénk a Hsp90 negyedleges szerkezetének problémájára. Ennek során a fehérjét tartalmazó folyadékoszlopot hirtelen hűtik le, az üveges vízben a natív szerkezet tanulmányozható. A svájci Biozentrumban már üzemel ilyen készülék, és remélhetőleg még az idén lehetőség kínálkozik a visszatérésre.

2.7.3.6. Az oligomer forma és a mikrotrabekuláris hálózat

Miért lehet létjogosultsága a Hsp90 oligomer szerkezetének? Egyrészt a Hsp90 passzív hő-indukált chaperon aktivitása egybeesik a stabil oligomerek megjelenésével, a szubsztrát pedig csak az oligomerekhez köt (Yonehara és mtsai, 1996; Nemoto és mtsai, 2001/b).

Ugyanakkor számtalan kísérletben bizonyították, hogy a Hsp90-nek fiziológiás hőmérsékleten is számottevő chaperon aktivitása van. Elképzelhető, hogy az itt jelentkező alacsonyabb hatásfokú chaperon aktivitás a kisebb mértékű/stabilitású oligomerek tulajdonsága, és az alacsony affinitású kölcsönhatások megintcsak átcsúsznak a hagyományos biokémiai metodikák relatíve érzéketlen szűrőjén. Ezt támogatja az is, hogy a Hsp90-et mindig nagy feleslegben és nagy koncentrációban szükséges a szubsztráthoz adni, hogy meggátolja az aggregációt. Hiába válik érzékelhetővé az oligomerizáció stressz (pl. hő) hatására, ez a Hsp90-szubsztrát arány javulásában nem tükröződik, ami arra utal, hogy a funkcióért felelős oligomerek már normál körülmények között (37°C-on) is az oldatban voltak, és/vagy arra, hogy a stabil Hsp90-szubsztrát komplexek létrejötte nem az oligomerizációnak, hanem egy azzal párhuzamos konformáció-változásnak köszönhető.

A Hsp90 számtalan specifikus és aspecifikus szubsztrátjaival, segítőivel, a citoszkeletális fehérjékkel is viszonylagosan alacsony affinitású, dinamikus kölcsönhatásrendszert alakít ki. Témavezetőm elképzelése szerint a dajkafehérjék nagy

mennyiségük és a nagyszámú kölcsönhatás révén a citoplazmatikus alapállomány rendezettségének fenntartásában és a benne zajló transzportfolyamatok rendezésében játszhatnak központi szerepet (Csermely és mtsai, 1998; Csermely, 2001/a). Kezdeti kísérletekben a Hsp90 „specifikus” gátlószerei, a geldanamycin, a radicicol – de nemkevésbé a novobiocin és a ciszplatin – fokozták az enyhe detergens kezeléssel permeabilizált sejtek fehérjéinek kiáramlását (Pató és mtsai, 2001). Az elméletnek ellentmond Susan Lindquist kutatócsoportjának eredménye, miszerint élesztőben a Hsp90 szintjének 95%-os csökkentése semmilyen nyilvánvaló elváltozással nem jár (Xu és Lindquist, 1993), tehát ahhoz, hogy ezt a sejtszintű szerepet bizonyíthassuk, a fehérjekiáramlást (különböző mennyiségű Hsp90-et tartalmazó) élesztősejteken is meg kell vizsgálni.

A citoplazmatikus dajkafehérje komplex specializáltabb, jelátviteli molekulák felgombolyodását, jelfeldolgozását és sejten belüli eloszlását, mozgását felügyelő (foldoszóma illetve transzportoszóma névvel illetett) működését leíró elmélet már korábban megszületett William Pratt agyában, melyet kísérletes bizonyítékokkal támasztott alá (Pratt, 1992; Owens-Grillo és mtsai, 1996; Pratt, 1997; Pratt és mtsai, 1999). Az elmélet általánosításához a citoplazmatikus folyamatok túlzott rendezettségén túl két megfigyelés adott szilárd alapot. Az első a mikrotrabekuláris hálózat detektálása a citoplazma „elmozdítható” részének óvatos kimosása után (Schliwa és mtsai, 1981). A másik az a felfedezés, hogy a prokarióta (eubakteriális) és eukarióta sejt között elhelyezkedő archebaktériumok Hsp60-rendszere mikrofilamentáris struktúrát képez (Trent és mtsai, 1997), és a filamentáris chaperon fehérjevédő aktivitása csökkent (Trent és mtsai, 1998). A Hsp90 alacsony affinitású oligomer struktúrájának igazolása fizikai alapot nyújtana a térben és időben rendkívül dinamikus, sokrétű és szerteágazó folyamatok szervezőjével szemben támasztott kívánalmakra.

2.7.3.7. Stressz és oligomerizáció

Akár a natív állapot dimer, akár oligomer, az oligomerizáció nagy jelentőséggel bírhat a stressz-indukált sejtválaszban. A stressz (hő, ATP-depléció) stabilizálja a Hsp90 oligomerjeit és szubsztrátjaival alkotott komplexeit, viszont megszünteti a folyamatok dinamikáját, ami magyarázatot kínál arra, hogy a különféle stresszek (pl. hő, ATP-depléció, divalens kationok) miért vezetnek a transzportfolyamatok széteséséhez, ugyanakkor a citoszkeletális-mikrofilamentáris rendszer stabilizálódásához. A prokarióta sejt hasonló eredményt ér el, eltérő molekuláris mechanizmussal. A hősokkolt sejtben a Hsp60-homológ GroEL visszatekerő aktivitása átmenetileg szünetel, ám az oligomerizáció nem változik. Az apikális

domének konformáció-változása meggátolja a GroEL-gyűrűk közötti, a szubsztrát elengedését lehetővé tevő jelátvitelt, a chaperonin az aggregáció által fenyegetett fehérjéket a stressz végéig tárolja (Llorca és mtsai, 1998). Az eukarióta sejt citoplazmatikus Hsp60 homológja (TCP1/TRiC) csak a szubsztrátok szűk csoportjának dajkálásában vállal szerepet, ezért valószínű, hogy az egyébként is nagy mennyiségben jelenlevő Hsp90 vette át ezt a funkciót. A Hsp90 tároló működésének molekuláris alapjaira egy lehetséges magyarázat látszik kibontakozni kísérleteink és más munkacsoportok eredményei alapján. Maga a hőkezelés gátolja a Hsp90 ATP-kötését (Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények), így disszociáló tényező hiányában a Hsp90 aspecifikus szubsztrátjaival (Young és mtsai, 1997; Scheibel és mtsai, 1998) specifikus klienseivel (Young és Hartl, 2000) és az aktinnal (Kellermayer és Csermely, 1995) kialakított komplexe stabilizálódik. Az ATP szerepét támasztja alá, hogy ATP hiányában vagy ADP jelenlétében a Neurospora crassa Hsp90 oligomer formája stabilizálódhat (Ouimet és Kapoor, 1999), ATP és ADP a csirke Hsp90a hő-indukált oligomerizációját gátolja (Chadli és mtsai, 1999). Feltételezzük, hogy a Hsp90-központú chaperon komplex asszociációs-disszociációs folyamatainak dinamikáját a Hsp90 nukleotid-ciklusának megszakítása befagyasztja. A modellt Az eredmények megbeszélése fejezetben a 6.5. ábrán vázoltam fel. Természetesen a hipotézis bizonyítása mindenek előtt az oligomer krio-elektronmikroszkópos detektálását, és az ATP-től remélt gátló hatás kimutatását igényli, melyet funkcionális kísérletek követhetnek.