__________________________________________________________________________________
Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program
Doktori (Ph.D.) értekezés
A H SP 90 NUKLEOTIDKÖTÉSÉNEK VIZSGÁLATA
Dr. Sőti Csaba
Témavezető:
Dr. Csermely Péter egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem
Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet
Budapest 2002
__________________________________________________________________________________
Ö
SSZEFOGLALÁSA 90 kDa molekulatömegű stresszfehérje (Hsp90) az eukarióta sejt esszenciális dajkafehérjéje. N-terminális ATP-kötő és C-terminális dimerizációs doménjét egy töltött aminosavakban gazdag régió köti össze. Chaperon hatása nélkülözhetetlen a labilis szerkezetű fehérjék felgombolyodásához, stabilizálásához. Az ún. kliensfehérjék a jelátviteli folyamatok kulcsmolekulái (p53, src, Raf, telomeráz), így a Hsp90 funkciójának csökkenése fontos szerepet játszhat az epigenetikus evolúcióban, a civilizációs betegségek elterjedésében, farmakológiás gátlása pedig a daganatellenes terápiában.
A Hsp90 funkcióját kismolekulák szabályozzák. A chaperon ciklust a fehérje ATP- kötése és ATPáz aktivitása működteti. Az N-terminális ATP-antagonista geldanamycin, illetve az ismeretlen szerkezetű endogén “stabilizátorok” az ATP-ciklust különböző stádiumokban befagyasztják, a kliens aktivációját meggátolják. A Hsp90 kismolekulákkal kialakított kölcsönhatásainak tanulmányozása által képet kaphatunk egy ismeretlen, esszenciális funkció molekuláris alapjairól, valamint olyan gyógyszerekhez juthatunk, melyekkel korunk népbetegségeit, így keringési és degeneratív betegségeket, többek között daganatokat gyógyíthatunk.
A Hsp90 endogén stabilizátorait modellező átmenetifém-anionokkal, illetve nukleotidokkal kialakított kölcsönhatását vizsgáló kísérleteink legfontosabb eredményei az alábbiakban foglalhatók össze:
1., Kimutattuk a Hsp90 kölcsönhatását különféle különböző vanadát-oligoanionokkal, illletve permolibdáttal. A permolibdát kötésében részt vevő régiót a Hsp90 középső doménjére lokalizáltuk.
2., Igazoltuk, hogy a Hsp90 rendelkezik egy második, középső-C-terminális doménen elhelyezkedő ATP-kötőhellyel, mely ciszplatinnal specifikusan gátolható. Azonosítottunk egy új N-terminális g-foszfátkötő motívumot, és ennek közelében találtunk rá a C-terminális foszfát-kötő szakaszokra.
3., Eredményeink szerint a Hsp90 töltött régiója egy nukleotid-függő molekuláris kapcsoló, mely csak az N-terminális ATP kötése után teszi lehetővé a C-terminális ATP- kötést. A két domén oda-vissza irányuló, szétkapcsolható kölcsönhatásban van.
4., Kísérleteink először mutatták ki a ciszplatin különböző Hsp90-komplexekre kifejtett hatását, így elsőként szolgálnak funkcionális bizonyítékkal az N- és C-terminális ATP- kötőhely eltérő biológiai szerepéről. Ciszplatin nem befolyásolta a Hsp90 N-terminális (p23-) komplexének kialakulását, de stabilizálta a C-terminális (Hsp70-) komplexet. A Hsp90-függő kliensfehérjék közül nem hatott az Lck és Raf-1 aktiválódására, ezzel szemben gátolta a luciferáz felgombolyodását. Eredményeink alapján a ciszplatin újabb eszköze lehet a Hsp90 működés modulálásának, és specifikusabb származékaiból “második generációs Hsp90- inhibitorok”, ígéretes daganatellenes szerek vagy egyéb gyógyszerek válhatnak, melyek segítséget nyújthatnak a C-terminális nukleotid-kötőhely biológiai szerepének felderítésében.
S
UMMARYThe 90 kDa heat shock protein (Hsp90) is an essential molecular chaperone of eukaryotic cells. It is composed of a non-canonical N-terminal ATP-binding domain and a C- terminal dimerization domain, connected by a highly charged region. Hsp90, as central part of a multiprotein complex, the foldosome chaperones a wide variety of inherently unstable
’clients’, mostly represented by key signalling molecules, such as p53, src, Raf, telomerase, or even mutant proteins. A decrease in Hsp90 function may lead to sudden epigenetic evolutionary changes, epidemic appearance of civilizational diseases. Pharmacological inhibition of Hsp90 is an emerging strategy in antitumor therapy.
Hsp90 function is modulated by low molecular weight compounds. The chaperone cycle is driven by its ATP-binding and ATPase activity, while the N-terminal ATP-antagonist geldanamycin and hitherto unidentified endogenous cytosolic stabilizers freeze Hsp90 at different stages of the cycle, abolishing client protein activation. Studying these interactions provides a detailed view on the molecular mechanism of Hsp90 action as well as promotes the development of new drugs effective against age-related degenerative disorders, such as diabetes, cardiovascular diseases and cancer.
We set out to study the interaction of Hsp90 with nucleotides and with transition state metal oxyanions, model compounds for the endogenous stabilizers. Our major findings are summarized as follows.
1., We could demonstrate a direct binding of different vanadate oligoanions and permolybdate to Hsp90. The permolybdate-binding region is mapped to the middle domain of Hsp90.
2., We showed that Hsp90 possesses a second, C-terminal ATP-binding site. Cisplatin is a specific inhibitor of the C-terminal nucleotide-binding domain. We identified a novel N- terminal g-phosphate-binding motif in the middle domain in close proximity or overlapping with the C-terminal phosphate-binding sites.
3., The charged region is a nucleotide-dependent molecular switch, which liberates the C-terminal nucleotide-binding domain upon N-terminal ATP-binding. The nucleotide-binding domains have an intricate allosteric communication that can be uncoupled.
4., Using geldanamycin, novobiocin and cisplatin we presented functional evidence on the divergent biological roles of the N- and C-terminal nucleotide-binding sites, respectively.
Cisplatin did not affect N-terminal (p23-) complex formation in vitro, while stabilized the C- terminal Hsp90-Hsp70 complex in vivo. Lck and Raf-1 activation in T-cells was not abrogated by cisplatin, however, luciferase refolding was potently inhibited in reticulocyte lysate. Our data suggest that cisplatin may be a novel tool to manipulate Hsp90 function, facilitating the design of “second generation Hsp90-inhibitors”. The specific compounds may be promising drug-candidates, and may contribute to elucidate the importance of the C-terminal nucleotide- binding domain in a number of (patho)physiological processes.
T
ARTALOMJEGYZÉK1. Bevezetés . ... 1
2. Irodalmi áttekintés... 3
2.1. A dajkafehérjék: életbiztosítás sejtszinten... 3
2.2. A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család... 5
2.3. A Hsp90 gén és kifejeződése ... 6
2.4. A Hsp90 általános szerkezeti vonásai... 9
2.4.1. A Hsp90 domén-szerkezete... 9
2.4.2. A Hsp90 poszttranszlációs módosulása... 10
2.4.3. A Hsp90 fő immunogén régiói... 11
2.5. A Hsp90 doménjeinek elrendeződése ... 12
2.5.1. Intramolekuláris kölcsönhatás és chaperon funkció ... 12
2.5.2. Intermolekuláris kölcsönhatások a Hsp90-dimerben... 12
2.5.3. Feltételezhető domén-domén kölcsönhatások ... 13
2.6. A Hsp90 doménjeinek finomszerkezete... 14
2.6.1. Az N-terminális ATP-kötő domén ... 14
2.6.1.1. A GHKL fehérje család ... 15
2.6.1.2. Az ATP-kötés szerkezeti alapjai... 16
2.6.1.3. A Hsp90 ATPáz aktivitása... 17
2.6.1.4. A C-terminális régió hatása az ATPáz aktivitásra ... 20
2.6.1.5. Az ATP-függő molekuláris fogó... 21
2.6.1.6. A GHKL-domén specifikus gátlószerei... 22
2.6.2. A töltött régió... 23
2.6.2.1. A töltött régió autonóm szerkezete ... 23
2.6.2.2. A töltött régió indukált szerkezete működésének fontos tényezője lehet ... 25
2.6.2.3. A töltött régió kalcium kötése... 26
2.6.2.4. A töltött régió foszforilációja... 27
2.6.2.5. A töltött régió szerepe a Hsp90 chaperon működésében... 28
2.6.2.6. A töltött régió szerepe a Hsp90 sejten belüli elhelyezkedésében ... 29
2.6.3. A középső és a C-terminális domén... 30
2.7. A Hsp90 által kialakított kölcsönhatások... 31
2.7.1. A Hsp90 kölcsönhatásai kismolekulákkal ... 32
2.7.1.1. A középső-C-terminális domén kötőhelyei... 32
2.7.1.2. Taxol kötés az N-terminálison ... 34
2.7.2. A Hsp90 kölcsönhatásai makromolekulákkal... 34
2.7.2.1. Az N-terminális domén... 34
2.7.2.2. A töltött régió... 34
2.7.2.3. A középső-C-terminális domén... 35
2.7.3. A Hsp90 oligomerizációja, avagy kölcsönhatások önmagával... 37
2.7.3.1. A Hsp90 oligomerek előfordulása ... 37
2.7.3.2. Az oligomerizáció szerkezeti alapjai ... 38
2.7.3.3. A Hsp90 elektronmikroszkópos képe – ahogy én láttam... 38
2.7.3.4. A fánkok a natív Hsp90 homo-oligomerjei... 40
2.7.3.5. Az oligomerek vizsgálata egyéb módszerekkel ... 42
2.7.3.6. Az oligomer forma és a mikrotrabekuláris hálózat... 44
2.7.3.7. Stressz és oligomerizáció... 45
2.8. A Hsp90 biológiai szerepe... 46
2.8.1. A Hsp90 passzív chaperon működése... 48
2.8.1.1. A passzív chaperon szerep teret nyer a törzsfejlődés során... 48
2.8.1.2. A Hsp90 chaperon kötőhelyei... 50
2.8.1.3. A passzív chaperon aktivitás jelentősége... 51
2.8.2. A Hsp90 aktív chaperon működése ... 52
2.8.2.1. Kiket?... 52
2.8.2.2. Mit?... 52
2.8.2.3. Kikkel?... 55
2.8.2.4. Miért?... 59
2.8.3. A Hsp90 ezoterikus sajátosságai... 60
3. Célkitűzések... 62
4. Vizsgálati módszerek ... 63
4.1. Általános megfontolások... 63
4.1.1. Anyagok... 63
4.1.2. A Hsp90 aminosav sorrendje... 63
4.1.3. ATP-regenerációs rendszer... 63
4.2. Biokémiai, in vitro módszerek ... 63
4.2.1. A Hsp90 fehérjék eredete, kifejezése, tisztítása ... 63
4.2.2. Különböző tagszámú vanadát oligoanionok előállítása... 64
4.2.3. A Hsp90 permolibdát-módosításának vizsgálata... 64
4.2.4. A Hsp90 triptikus emésztése... 65
4.2.5. A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen... 65
4.2.6. A Hsp90 fotoaffinitás jelölése [a-32P]ATP-vel ... 65
4.2.7. g-foszfát-kapcsolt ATP-Sepharose gyanta kötés... 66
4.2.8. Oxidatív nukleotid-affinitáshasítás ... 66
4.2.9. Hsp90-ATP nitrocellulóz filter kötés... 67
4.2.10. A Hsp90-p23 komplex in vitro összeépítése ... 67
4.2.11. Hődenaturált luciferáz renaturációja retikulocita lizátumban ... 67
4.3. Biofizikai, szerkezetvizsgálati módszerek ... 68
4.3.1. Távoli ultraibolya tartományú cirkuláris dikroizmus mérés... 68
4.3.2. Felületi plazmon rezonancia (SPR) mérés... 68
4.3.3. 51V-NMR mérés ... 69
4.4. Sejtbiológiai, in vivo módszerek ... 70
4.4.1. Sejtkultúra... 70
4.4.2. A Hsp90 ATP-kötésének in situ vizsgálata... 70
4.4.3. A Hsp90-Hsp70 in vivo komplexének vizsgálata ... 70
4.4.4. Raf-1 és Lck aktivációjának és mennyiségének vizsgálata T-sejteken... 70
4.5. Általános analitikai módszerek ... 71
4.5.1. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)... 71
4.5.2. Western blot... 71
4.5.3. Fehérjekoncentráció meghatározás... 72
4.6. Bioinformatikai módszerek... 72
4.6.1. Páros és többszörös szekvencia illesztés ... 72
4.6.2. A Hsp90 N-terminális g-foszfát kötőhelyének azonosítása ... 72
5. Eredmények... 74
5.1. A Hsp90 kölcsönhatása vanadát oligoanionokkal... 74
5.1.1. Immobilizált Hsp90 vanadát kötése... 74
5.1.2. A Hsp90 vanadát kötésének vizsgálata 51V-NMR-rel ... 76
5.2. A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal... 77
5.2.1. A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása ... 78
5.2.2. A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése ... 79
5.2.3. A permolibdát-kötőhely térképezése ... 80
5.3. A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel ... 81
5.3.1. A Hsp90 [a-32P]ATP kötésének vizsgálata natív gélen... 83
5.3.2. A Hsp90 nukleotid kötésének vizsgálata SPR-rel... 84
5.3.3. A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kimutatása nukleotid-affinitáshasítással... 85
5.3.4. A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel ... 87
5.3.5. Két eltérő ATP-kötőhely kimutatása nitrocellulóz filter kötéssel ... 88
5.3.6. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek feltérképezése... 90
5.3.6.1. Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása ... 90
5.3.6.2. Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója... 91
5.3.6.3. A foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel ... 92
5.3.7. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága... 93
5.3.8. A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek tulajdonságai ... 95
5.3.9. Az N- és C-terminális ATP-kötőhelyek kölcsönhatásai ... 97
5.3.10. A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére... 99
5.3.11. Taxol megbontja az N-és C-terminális domén kommunikációját...100
5.3.12. A Hsp90 nukleotid-kötésének meghatározása in situ...100
5.4. Ciszplatin hatása a Hsp90 biológiai funkciójára...101
5.4.1. Ciszplatin hatása a Hsp90 N-terminális komplexének összeépülésére in vitro ...102
5.4.2. Ciszplatin hatása a Hsp90 C-terminális komplexének stabilitására in vivo...102
5.4.3. Ciszplatin hatása a T-sejt-aktivációs jelpálya Hsp90-függő kinázaira in vivo ...103
5.4.4. Ciszplatin hatása a Hsp90-függő kliensfehérje renaturációjára in vitro...104
6. Az eredmények megbeszélése...105
6.1. A Hsp90 kölcsönhatása vanadáttal ...105
6.1.1. A Hsp90-oligovanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe ...105
6.1.2. A Hsp90-dekavanadát kölcsönhatás lehetséges szerepe...106
6.2. A Hsp90 kölcsönhatása permolibdáttal...106
6.2.1. A permolibdát, mint molibdát analóg vagy SH-reagens...106
6.2.2. A Hsp90 reaktív SH-csoportjai...107
6.3. A Hsp90 kölcsönhatása ATP-vel ...108
6.3.1. Az N-terminális nukleotid-kötőhely ...108
6.3.2. A C-terminális nukleotid-kötőhely ...109
6.3.3. Az N- és C-terminális nukleotid-kötőhely kölcsönhatása...111
6.3.4. Párhuzamok a Hsp104-gyel ...114
6.4. A ciszplatin lehetséges szerepe a Hsp90 működésében...115
6.5. Szerkezet-hatás összefüggések...117
7. Új tudományos eredmények...120
7.1. Új kísérleti eredmények ...120
7.2. Új módszertani eredmények...121
8. A kutatás további irányai ...122
9. Köszönetnyilvánítás ...123 10. Irodalomjegyzék...I
11. Saját közlemények jegyzéke...XVI Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények...XVI Az értekezés témaköréhez szorosan nem kapcsolódó közlemények...XVI
R
ÖVIDÍTÉSEK,
MAGYARÁZATOKAha-1 Activator of Hsp90 ATPase 1 as aminosav ATP adenozin-trifoszfát ATPgS adenozin-5’-O-(tiotrifoszfát)
BCK elágazó szénláncú a-ketosav dehidrogenáz kináz, eukarióta hisztidin kináz BiP Immunoglobulin nehézlánc kötő (binding) protein, Grp78
Brij 98 polioxietilén-éter, detergens
CD cirkuláris dikrozimus, optikai szerkezetvizsgáló módszer
Cdc cell division cycle, az élesztő sejtciklusában szerepet játszó gén(termék)ek elnevezése
CDK ciklin-dependens kináz
CFTR cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor, kloridcsatorna fehérje CheA bakteriális GHKL-típusú hisztidin kináz
ClpA/X ATP-függő prokarióta proteáz
CP cisz-diamin-dikloro-platinum(II), ciszplatin, kemoterápiás szer
Cyp40 ciklofilin, ciklosporin A-kötő dajkafehérje peptidil-prolil izomeráz aktivitással DEAE dietil-amino-etán
DMSO dimetil-szulfoxid
DnaJ az E. coli 40 kDa-os dajkafehérjéje (Hsp40 homológ) DTT D,L-ditiotreitol
ECL kemilumineszcenciás Western-blot detektálási módszer eEF-2a eukarióta elongációs faktor 2 a alegysége
eIF-2a eukarióta iníciációs faktor 2 a alegysége EnvZ bakteriális GHKL-típusú hisztidin kináz
ER endoplazmás retikulum
FK506 immunszuppresszív makrolid, amely a T-sejt aktiváció több lépését is gátolja;
10-100-szor hatásosabb, mint a ciklosporin A
FKBP FK506-kötő dajkafehérjék peptidil-prolil izomeráz aktivitással
FPLC középnyomású folyadék-kromatográfia
FSBA fluoro-szulfonil-benzoil-adenozin, a fehérjéhez kovalensen kötő ATP-analóg Fyn tirozin-kináz, az Src család tagja
GA geldanamycin; a Hsp90 specifikus gátlószere, daganatellenes antibiotikum
GHKL giráz, Hsp90, hisztidin kináz, MutL fehérjéket magában foglaló ATPáz/kináz szupercsalád GimC riboszóma-asszociált chaperon, prefoldin
Gp96 a humán Grp94 neve
GR glukokortikoid-receptor GroEL az E. coli Hsp60-homológja, dajkafehérje GroES az E. coli Hsp10-homológja, dajkafehérje
Grpxy glukóz-regulált fehérje, az xy a protein relatív molekulatömegére utal (kDa) GyrB DNS giráz (prokarióta topoizomeráz) GHKL-típusú B alegysége
Hap1 hem aktivátor protein 1, az élesztő hemfüggő transzkripciós faktora HBGp82 agyi Hsp90 homológ lektin
Hip a Hsp70 ko-chaperonja (Hsp70 interacting protein/p48)
HPLC magasnyomású folyadékkromatgráfia
Hop a Hsp70 és Hsp90 kapcsolódását segítő ko-chaperon (Hsp organizing protein/p60/Sti1) HSF hősokk transzkripciós faktor
HSJ1b a Hsp40 család emberi idegszövetben megtalálható tagja Hscxy az adott hősokk fehérje konstitutív formája
Hsp90N membránkötött onkogén Hsp90 homológ
Hspxy hősokk fehérje, az xy a fehérje relatív molekulatömegére utal (kDa) HtpG az E. coli Hsp90-homológja
IPTG izopropil-b-D-tiogalaktopiranozid, nem metabolizálódó laktóz analóg JFC1 ismeretlen funkciójú, GHKL-típusú fehérje
KEKE Lys/Glu tartalmú, fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában részt vevő szekvencia Lck limfoid sejtek tirozin kináza, a nyiroksejt aktivációs kaszkád korai tagja
MAP mikrotubulus-asszociált protein MBP maltózkötő fehérje
MEK MAP-kináz-kináz
MutL GHKL típusú mismatch repair fehérje
NAD(P)+ nikotinamid-adenin-dinukleotid(-foszfát), redox koenzim NFkB transzkripciós faktor, a natív immunitás karmestere NLS nukleáris lokalizációs szignál
NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia, szerkezetvizsgálati módszer NSF N-etil-maleimid-szenzitív faktor, a vezikuláris fúzióban szerepet játszó fehérje OKT3 a CD3 T-sejt receptor e lánca elleni monoklonális, aktiváló antitest
p53 tumor szuppresszor fehérje, transzkripciós faktor PAR proteáz-aktivált receptor, trombin receptor
PBS izotóniás foszfátpuffer
PDI fehérje diszulfid izomeráz
PDK piruvát dehidrogenáz kináz, eukarióta hisztidin kináz PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid
PPI peptidil-prolil cisz-transz izomeráz (rotamáz)
PP5 TPR-domént tartalmzó szerin/treonin foszfatáz, a Hsp90 ko-chaperonja PVDF polivinilidén-difluorid
Raf a MAP-kináz jelpálya szerin/treonin kináza, MAP kináz kináz kináz Ras membrán-asszociált kismólsúlyú GTP-kötő fehérje (GTP-áz) Rd radicicol, nem anzamycin szerkezetű Hsp90-gátlószer SDS nátrium-dodecil-szulfát
SDS-PAGE SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis
SPR felületi plazmonrezonancia, asszociációs-disszociációs folyamatok paramétereinek valós idejű meghatározására szolgáló módszer
Src csirke Rous szarkóma vírus onkogénje, tirozin-kinázt kódol
TCP1/TRiC t(ailless)-komplex polipeptid 1 (eukarióták citoszolikus Hsp60 homológja) TNFa tumor nekrózis faktor a, citokin
TP transz-diamino-dikloro(II)-platinum, klinikailag hatástalan platinavegyület Trap1 mitokondriális Hsp90 homológ, Hsp75
WB Western-blot
Á
BRÁK2.3.ábra A Hsp90-HSF autoregulációs hurok... 7
2.4. 1. ábra A Hsp90 domén-szerkezete és triptikus fragmentumainak elhelyezkedése ... 9
2.6.1. ábra A Hsp90 ATP-kötő doménjének kristályszerkezete ... 14
2.6.2.1. ábra A töltött régió szerkezete... 24
2.6.2.3. ábra A töltött régió-Hsp90 kölcsönhatás modellje ... 27
2.6.2.4. ábra A töltött régió konformációs állapotainak modellje ... 28
2.7.1.1. ábra A Hsp90 ligandkötőhelyei... 32
2.7.1.2. ábra A Hsp90-család lehetséges taxolkötő motívumai ... 34
2.7.3.3. ábra A Hsp90 elektronmikroszkópos képe... 39
2.7.3.4. ábra A Hsp90 specifikus oligomer struktúrája ... 41
2.8. ábra A Hsp90 aktív és passzív chaperon működésének szakaszai... 47
2.8.2.3. ábra A Hsp90 ATP-függő chaperon ciklusa... 56
2.8.2.4. ábra A Hsp90 szerepe a transzkripciós faktorok működési ciklusában ... 60
5.1.1. ábra A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata SPR-rel ... 75
5.1.2. ábra A Hsp90-vanadát kölcsönhatás vizsgálata 51V-NMR-rel... 76
5.2.1. ábra A Hsp90 permolibdát-indukált kovalens módosítása ... 78
5.2.2. ábra A Hsp90 permolibdát kötésének jellemzése... 79
5.2.3. ábra A Hsp90 permolibdát-kötőhelyének térképezése ... 80
5.3.1. ábra A Hsp90 [a-32P]ATP-kötésének vizsgálata natív gélen... 83
5.3.2. ábra A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata SPR-rel... 84
5.3.3. ábra A Hsp90 nukleotid-affinitáshasítása... 86
5.3.4. ábra A nukleotid-affinitáshasítás igazolása egyéb kísérletekkel... 87
5.3.5. ábra A Hsp90 ATP-komplex nitrocellulóz filter kötése ... 89
5.3.6.1. ábra Az N-terminális ATP-kötőhely azonosítása Edman-degradációval... 90
5.3.6.2. ábra Az N-terminális g-foszfát-kötőhely predikciója... 91
5.3.6.3. ábra Az ATP-foszfát-kötőhelyek behatárolása epitop térképezéssel... 93
5.3.7. ábra A Hsp90 ATP-kötőhelyeinek gátolhatósága... 94
5.3.8. ábra A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek tulajdonságai... 96
5.3.9. ábra A Hsp90 nukleotid-kötőhelyeinek kölcsönhatása... 98
5.3.10. ábra A p23 partnerfehérje hatása a Hsp90 ATP-kötésére... 99
5.3.11. ábra Taxol hatása a Hsp90 ATP-kötésére ...100
5.3.12. ábra A Hsp90 ATP-kötésének vizsgálata in situ...101
5.4.1. ábra Ciszplatin hatása a Hsp90-p23 komplex összeszerelésére in vitro...102
5.4.2. ábra Hsp90-ligandok hatása a Hsp90-Hsp70 komplexre in vivo...103
5.4.3. ábra Hsp90-ligandok hatása a Raf-1 kináz foszforilációjára in vivo...103
5.4.4. ábra Platinavegyületek hatása a luciferáz renaturációjára in vitro...104
6.3.2. ábra A Hsp90 fehérjecsalád feltételezett adeninkötő motívuma...110
6.3.3.1. ábra A Hsp90-monomer ATP-függő molekuláris kapcsolójának modellje ...112
6.3.3.2. ábra A Hsp90-dimer ATP-függő molekuláris kapcsolójának modellje...113
6.5. ábra A Hsp90 nukleotid-állapotának, oligomerizációjának és chaperon aktivitásának kapcsolata ..119
T
ÁBLÁZATOK2.1. táblázat A dajkafehérje családok... 4
2.2. táblázat A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család tagjai... 5
2.6.1.1. táblázat A GHKL ATPáz/kináz szupercsalád tagjai ... 15
2.6.1.2. táblázat A GHKL ATP-kötő domén konszenzus motívumai ... 16
2.6.1.3. táblázat Különböző fajokból származó Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása... 19
2.6.1.4. táblázat C-terminálisan trunkált Hsp90 fehérjék ATPáz aktivitása... 20
2.6.1.6. táblázat A Hsp90 N-terminális ATP-antagonistáinak jellemzői... 23
2.6.3. táblázat A Hsp90 deléciós mutánsainak tulajdonságai... 30
2.7.2.3. táblázat A Hsp90 kochaperonjai ... 36
2.8.1.2. táblázat A Hsp90 chaperon kötőhelyei ... 50
2.8.2.1. táblázat A Hsp90-nel kapcsolódó kliens fehérjék ... 53
6.3.4. táblázat A Hsp90 és a Hsp104 nukleotidkötő tulajdonságainak összehasonlítása ...115
6.4. táblázat A Hsp90-kötő vegyületek hatásai és hatásmechanizmusa ...116
1. B
EVEZETÉSA többsejtű eukarióta élőlény rendkívül bonyolult organizmus, életben maradását számos (többszörösen átfedő, túlbiztosított) mechanizmus teszi lehetővé – sejtszinten és az élőlény szintjén egyaránt. A sejtszintű folyamatok már a prokariótákban megjelennek, és (alapelveik) szinte változatlanul öröklődnek tovább a legmagasabb rendű élőlényekig. Hogy csak pár ősi példát említsünk, ilyen a glikolízis, a transzláció, és ilyen a stresszválasz, avagy a dajkafehérjék általános sejtvédő feladata, melyek mind az egyed (a sejt) minden áron való túlélését biztosítják. A szöveti szerveződés megjelenése új kívánalmakat ró a sejtre. A “bármi áron túlélni” már nem örökérvényű szabály, belép a “szolgálni, eleget tenni, vagy az egyed érdekében meghalni” altruisztikus parancsolata. A szöveti szerveződés megjelenése elsősorban a sejten kívüli térből érkező üzenetek (növekedés, differenciálódás, sejt-sejt kapcsolat, programozott sejthalál) pontos továbbítását, másrészt a sejt reakcióképességének és épségének (ingerekkel szembeni érzékenység, sejtmozgások, anyagcsere, genom) szabályozását, illetve ellenőrzését kívánja meg; a fentiek elégtelensége vagy inkoherenciája esetén pedig a sejt képessé válik az önnön működését leállító parancs (szeneszcencia, apoptózis) kiadására és végrehajtására.
Mindezen forradalmi változások közben megtörténik, hogy addig jelentéktelennek tartott szereplők esszenciális feladatot kapnak. A sejt egyik ilyen szereplője a 90 kDa molekula- tömegű stresszfehérje, a Hsp90. Prokarióta homológja igazán lényeges feladatokat még nem lát el, génjének hiánya komoly következménnyel nem jár, az élesztőben viszont már két példányban jelenik meg (a és b izoforma), melyek együttes hiánya halálos. A Hsp90 – egyre inkább bizonyossá válik – az előzőekben felsorolt szinte minden eukarióta vívmánnyal szoros kapcsolatban van. Működésének lényege, hogy a folyamatokat kontrolláló fehérjék (kinázok, magi receptorok, p53 fehérje és mások) specifikus dajkája. Szerkezetét azért érdemes tanulmányozni, mert általa képet kapunk egy érdekes, esszenciális funkció molekuláris alapjairól, valamint olyan gyógyszerekhez juthatunk, melyekkel korunk népbetegségeit, így keringési és degeneratív betegségeket, többek között daganatokat gyógyíthatunk.
Laboratóriumunk egy évtizede foglalkozik a 90 kDa-os dajkafehérjék kutatásával.
Eredményeinket, feltevéseinket számos díjnyertes rektori pályamunka és szakdolgozat után három, ezidőtájt elkészített és készülő doktori értekezésben foglaljuk össze. Míg Schnaider
Tamás értekezése átfogó képet adott a stresszválaszról és a dajkafehérjékről, valamint a Hsp90 makromolekuláris kölcsönhatásairól, Nardai Gábor a dajkafehérjék kórélettanába enged betekintést, addig én a különböző kismolekulák Hsp90 szerkezetére és működésére gyakorolt hatását tűztem toll- és pipettahegyre. Értekezésem terjedelmének csökkentése érdekében az irodalmi áttekintés során többször hivatkozom saját összefoglaló közleményünkre (Csermely és mtsai, 1998), Schnaider Tamás doktori értekezésére (Schnaider, 2000) és témavezetőm könyvére (Csermely, 2001/c).
A terjedelmi korlátok mellett a bírálók feladatának egyszerűsítését tartottam szem előtt, amikor néhány eredményünket rendhagyó módon a módszerek részletes ismertetése nélkül az Irodalmi áttekintésbe illesztettem. Ezen eredményeket a tézisekben sem szerepeltettem, mert még nem mentek át a szakfolyóiratok bírálatának szűrőjén, mégis fontosnak tartottam bemutatásukat, mert kitágíthatják a Hsp90 szerkezet-hatás összefüggéseiről kialakított képünket, és teljesebbé tehetik értekezésemet.
Mielőtt a Tisztelt Olvasó belekezdene értekezésem olvasásába, előrebocsátom, hogy néha furcsa, „magyartalan” kifejezésekkel, elnevezésekkel találkozik a következő lapokon.
Ezek az idegenszerű nevek valójában annak a törekvésnek gyermekei, hogy magyar elnevezéseket találjunk a terjedőben levő, „magyarosabban” hangzó angolszász terminológia ellenében. A magyar a világ háromezer-valahányszáz nyelve közül azon néhány tucat egyike, melyen az összes tudományágat képesek vagyunk művelni. Ez a nyelvújítás rendkívül lekes, aktív tevékenységének köszönhető. Cserébe elnézhető az a néhány nyelvi ficam, amit szintén Kazinczyék mozgalmának tulajdonítanak. Bár felelősségem a tankönyvírókéhoz, tehetségem Kazinczyékéhez mérten csekély, a magam szintjén megpróbálok tenni azért, hogy nyelvünk szépsége és hagyományos értéke ne sorvadjon el, mert a nyelv maga a kultúra. Kérem a Tisztelt Olvasót, a ficamokat nézze el, és tegye helyre tehetsége szerint! Ha pedig jobb elnevezést talál, írja meg nekem, vagy a Biokémiai Társaságok honlapjának nevezéktannal foglalkozó címére (http://www.webio.hu/biochat/lada/index.php; email:
BioChat@WEBio.hu).
Budapest, 2002. március
Sőti Csaba csaba@puskin.sote.hu
2. I
RODALMI ÁTTEKINTÉS2.1. A dajkafehérjék: életbiztosítás sejtszinten
A fehérjék aminosav sorrendje egyedi módon kódolja a fehérje működése szempontjából optimális térszerkezetet, melynek kialakítására a fehérjék túlnyomó többsége megfelelő körülmények között képes. A sejtben korántsem megfelelőek a feltételek: a magas hőmérséklet és a makromolekuláris zsúfoltság segítséget kíván. A segítőket dajkafehérje (molekuláris chaperon) néven illetjük, bár nem valódi dajkák. Valójában a fehérje életének minden szakaszában jelen vannak, mintegy orvosként segítve a fehérje felgombolyodását, transzportját, működését, végül a proteolitikus temetőig kísérve őket (összefoglalásul ld. Hartl, 1996; Bukau és Horwich, 1998; Bukau 1999; Schnaider, 2000; Csermely, 2001/c).
Működésüket önkényesen passzív és aktív részre oszthatjuk. A passzív chaperon hatás lényege a hidrofób aminosavakban gazdag polipeptidláncok vagy a meztelen peptid-gerinc kis specificitású és affinitású kötése, mely meggátolja a felgombolyodó vagy denaturálódó fehérjék aggregációját. Passzív chaperon hatása minden dajkafehérjének van. Az aktív chaperon hatás a szubsztrát fehérje ciklikus kötése majd elengedése, részben aktív kitekeréssel zajlik, meggátolja a tekeredési zsákutcákba jutást, és statisztikusan lehetőséget teremt a megfelelő tekeredési útvonal megtalálására. Az aktív chaperon hatás mindig energiaigényes folyamat; vagy ATP hidrolízise (Hsp70, Hsp60, Hsp110), vagy a redoxpotenciál (diszulfid- hidak reverzíbilis redukciója, fehérje diszulfid izomeráz) terhére történik. Aktív chaperon hatás segít az újonnan szintetizálódó vagy denaturált fehérjék felgombolyodásában, az oligomerek össszeszerelésében, a sejtalkotókba (mitokondrium, endoplazmás retikulum) történő bejuttatásában, a fehérjeaggregátumok szétszerelésében, és a menthetetlen fehérjék eltakarításában (bemutatás a citoszolikus, ritkábban a lizoszómális fehérjebontó apparátusnak).
A dajkafehérjék nagy része stresszfehérje is, azaz valamilyen nem specifikus fehérje- és/vagy lipidkárosító (pl. hősokk) inger fokozza termelődésüket, így a sejt képessé válik működésének helyreállítására, sőt – akár a rákövetkező károsító inger közepette – fenntartására (pl. termotolerancia). Különböző ingerek kereszttoleranciát váltanak ki. A stresszfehérjék szintje így “edzéssel” vagy gyógyszeresen növelhető, mely az egyed jobb életkilátásait eredményezi, és jelentős orvosi vonatkozásokkal kecsegtet (Welch, 1992).
A prokarióta sejt fehérjéinek felgombolyodása döntően a transzlációt követően megy végbe, és a dajkafehérjék aktív segítségét igényli. Az eukarióták nagyobb, több doménből álló fehérjéi nem tudnának így betekeredni. A riboszóma és a riboszóma-asszociált chaperonok (melyek nemcsak stresszfehérjék) veszik át a klasszikus dajkafehérjék feladatát (összefoglalásul ld. Netzer és Hartl, 1998). Bár az eukarióta chaperonok korántsem maradnak feladat nélkül, indokolatlannak látszik, hogy mind a Hsp70, mind a Hsp90 külön-külön kitegye a sejt fehérjekészletének 1-5%-át. Elképzelhető, hogy a nagy mennyiségű dajkafehérje egy olyan dinamikus komplexet alkot, mely a sejt alapvázát képezi, és kis affinitású fluktuáló kölcsönhatások révén összetartja, mozgatja és irányítja a spontán diffúzióval nem magyarázható molekuláris mozgásokat (összefoglalásul ld. Pratt, 1997; Pratt és mtsai, 1999;
Csermely, 2001/a). Ez az általános szerep magyarázhatja a stresszválasz korral járó kimerülését, az öregedés beindulását és a degeneratív betegségek illetve daganatok megjelenését (Sőti és Csermely, 1998/b; 2002/a; 2002/b; Csermely, 2001/b).
Család Képviselők Chaperon működés Speciális szerep Irodalom Kisméretű Cpn10, GimC, Hsp25,
Hsp27, krisztallinok
aggregáció gátlás apoptózis, neurodegeneráció
Arrigo, 1998 Sőti és Csermely, 2002/b Hsp40 Hsp40, Hdj1, Hdj2
Hsj1a, Hsj1b
aggregáció gátlás Hsp70 segéd ATPáz aktivátor
Hartl, 1996;
Bukau, 1999 Hsp60 Cpn60, TCP-1 (TRiC) felgombolyodás,
összeszerelés
aktin, tubulin apoptózis
Thirumalai és Lorimer, 2001 Hsp70 Hsc70 (Hsp73), Hsp70
(Hsp72), Prp73, mortalin
Grp78 (BiP), mtHsp70
de novo szintézis, felgombolyodás, transzport, lebontás
immortalizáció apoptózis immunitás evolúció
Bukau, 1999 Schnaider, 2000 Srivastava és mtsai, 1998
Chow, 2000 Hsp90 ld. 2.2. táblázat aggregáció gátlás,
szerkezet stabilizálás jelátvitel daganatképződés immunitás evolúció
Csermely és mtsai, 1998 Young és mtsai, 2001 Srivastava és mtsai, 1998
McLaren, 1999 Hsp100 Hsp101/102, Hsp104
Hsp110, Grp170 ClpA/X (E. coli)
aggregátumok szétszedése, proteolízis (E. coli)
termotolerancia konformációs betegségek
Schirmer és mtsai, 1996 Ogura és Wilkinson, 2001 Sőti és Csermely, 2002/b
2.1. táblázat A dajkafehérje családok
A dajkafehérjék csoportosítása molekulatömegük alapján történik (2.1. táblázat). Az érdeklődő olvasó további információt talál a tematikus összefoglaló közleményekben. A továbbiakban a 90 kDa molekulatömegű dajkafehérjék családjával foglalkozom részletesebben.
2.2. A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család
Elhelyezkedés Képviselő
Faj Szerep/asszociáció Deléció Irodalom Prokarióta
Citoszol
HtpG eubaktérium ? marginális Bardwell és Craig, 1987 Eukarióta
Citoszol (sejtmag) Hsp90c/Hsp90i Hsc82/Hsp82 Hsp86/Hsp84 Hsp90b/Hsp90a
élesztő rágcsáló madár, emlõs
labilis konformációjú fehérjék stabilizálása, hősokk: általános chaperon
letális Mayer és Bukau, 1999 Richter és Buchner, 2001
Schnaider, 2000 Borkovich és mtsai, 1989 Hsp105 emlõs here p53 chaperon ? Kumagai és mtsai, 2000 HBGp82 lektin emberi agy galektin-1 ligand ? Chadli és mtsai, 1997 Endoplazmás retikulum
endoplazmin Grp94 Gp96
rágcsáló emlős
immunoglobulin-érés,
antigén bemutatás nem letális, naív immunitás
kiesik
Csermely és mtsai, 1998 Schnaider, 2000 Randow és Seed, 2001 Mitokondrium
Hsp75/Trap1 muslica, emlős TNFa-receptor Rb-fehérje chaperonja
? Chen CF és mtsai, 1996;
Song és mtsai, 1995;
Felts és mtsai, 2000 Plazmamembrán
Hsp90N emlős Raf aktiváció
(ras független)
? Grammatikakis és mtsai, 2002
2.2. táblázat A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérje család tagjai A Hsp90c és i a fehérje konstitutív és indukálható izoformájának felel meg
A 90 kDa molekulatömegű chaperonok eddig azonosított képviselőit a 2.2. táblázat szemlélteti. A prokarióta gén alapos átalakulása és többszörös duplikációja alakította ki a ma ismert eukarióta Hsp90 fehérjéket (Csermely és mtsai, 1998), ezzel együtt a bakteriális és a humán fehérje aminosavai 40%-ban azonosak, 54%-ban hasonlóak (Bardwell és Craig, 1987)!
A prokarióta HtpG fehérje csak rendkívül magas hőmérsékleten rendelkezik (passzív) chaperon aktivitással, deléciója csak ekkor válik hátrányossá az organizmusra nézve (Bardwell és Craig, 1988; Csermely és mtsai, 1998). Az egyre magasabb rendű szervezetek Hsp90 fehérjéinek hőstabilitása egyre kisebb, ezzel egyetemben passzív chaperon aktivitásuk hatékonyabb, és alacsonyabb hőmérsékleten jelentkezik (Jakob és mtsai, 1995/b; Nemoto és mtsai, 2001/b). Az eukarióta citoszol két általános izoformája, a Hsp90a és b 76%-ban azonosak, és több mint 90%-ban hasonlóak (Csermely és mtsai, 1998). A két izoforma között a szerkezeti és működésbeli hasonlóságból kifolyólag gyakran nem tesznek különbséget. Számos kísérleti rendszerben a humán fehérje helyreállítja a Hsp90-hiányos élesztő mutáns
életképességét, amely a bakteriális homológról nem mondható el (Picard és mtsai, 1990;
Buchner, 1999).
Az élőlények bonyolódásával a Hsp90 feladatai egyre sokasodnak. Ez azzal jár, hogy megjelennek a fehérje sejtalkotó-, szövet-, sőt szubsztrátspecifikus variánsai, és leveszik a többletmunkát a Hsp90 válláról. Erre kínál szép példát a Trap1/Hsp75, mely élesztőben még nem, csak muslicában jelenik meg. A muslica Trap1 66%-ban hasonlít a humán Trap1-hez, 50%-ban a humán Hsp90-ekhez. Bár domén-elrendeződése szerkezetileg a HtpG fehérjéhez teszi hasonlóvá, aminosavsorrendje csak 49%-os hasonlóságot mutat (Felts és mtsai, 2000).
Kérdéses, hogy a szűk szubsztrátspecificitású, mitokondriális Hsp90-homológ Trap1 hogyan találkozik „in vivo” szubsztrátjaival, a mebránban található TNFa-receptorral, illetve a sejtmagi/citoszolikus retinoblasztóma-fehérjével.
A „legfiatalabb”, legkisebb és legszélsőségesebb Hsp90-homológ a Hsp90N, melynek N-terminális ATP-kötő doménje helyén egy rövid hidrofób szekvencia és egy mirisztoilációs szignál található. A Hsp90N fehérje első példája annak, hogyan válhat egy dajkafehérje onkogénné. A fehérje Ras-deficiens sejtekben is képes a Raf-ot kicsalogatni a membránhoz és a MAP-kináz kaszkádot aktiválni, mely a sejtek daganatos elfajulását okozza (Grammatikakis és mtsai, 2002).
A továbbiakban a legfőbb képviselőt, az eukarióta Hsp90-et mutatom be, ahol a család egyéb képviselőinek tulajdonságai segítséget nyújthatnak a szerkezet és működés megértéséhez, ott egyértelműen utalok ezekre.
2.3 A Hsp90-gén és kifejeződése
A Hsp90 a és b izoformájának génjei – más stresszfehérjéktől eltérően – intronokat tartalmaznak. Mivel hősokk gátolja a splicing-ot, így a Hsp90 mRNS hősokkolt sejteken nem képes transzlálódni, bár egész muslica lárván a Hsp90 mRNS splicing-ja ellenállóbb a hőkezeléssel szemben (Csermely és mtsai, 1998). Mindazonáltal, ez megkérdőjelezné, hogy a Hsp90 fontos hősokk-fehérjeként funkcionáljon. A Hsp90 gének promotere két-két hősokk elemet tartalmaz, a konstitutív b izoforma kevésbé hő-indukálható. Növekedési jel többféle promoteren keresztül mindkét izoforma átíródását fokozza, ezzel szemben az immunsejtek aktivációja és a gyulladásos ingerek elsősorban a b izoforma transzkripcióját serkentik.
Természetesen szinte minden káros hatás – még a pszichés stressz is – képes a Hsp90 szintézisét fokozni (összefoglalásul ld. Csermely és mtsai, 1998).
Nakai és Ishikawa (2001) kísérletei nyomán a hősokk faktor, a Hsp90 és a sejtciklus kapcsolata új dimenzióval gazdagodott. A HSF-1 és -3 hiányos sejtekben a Hsp90b mennyisége közepesen (kb. 60%-ra), a Hsp90a-é jelentősen (25%-ra) csökkent normál hőmérsékleten, rámutatva a HSF konstitutív transzaktivációs, és a Hsp90 mennyiségére gyakorolt hatására. A Hsp90 relatív hiánya már enyhe hősokk hatására is a Cdc2 (CDK1) kináz destabilizálódáshoz vezet, ami leállítja a sejtciklust. A Hsp90a mennyiségének növelése stresszválasz hiányában is helyreállítja a sejtosztódást. A szerzők arra is rámutattak, hogy a Hsp90 mennyiségének a normál szint fölé növelése sem lehetséges, intenzív apoptotikus hatása miatt. A jelen és más kísérletek (Rutherford és Lindquist, 1998; Imai és Yahara, 2000) fő tanulsága, hogy a sejt (és a szervezet) működéséhez a Hsp90 mennyiségét szűk határok között kell tartani, mert különben a jelátviteli folyamatok káosza uralkodik el. A hősokk faktorok szerepe a Hsp90 szintjének szabályozásában (stresszmentes körülmények között is) kulcsfontosságú. A Hsp90-komplex a hősokk faktort is fogságában tartja, végső soron egy önszabályozó hurokkal saját mennyiségét határozza meg (2.3. ábra).
Hsp90 HSF-1
jelátvitel stresszválasz
+
-
denaturált fehérje geldanamycin
2.3. ábra A Hsp90-HSF autoregulációs hurok
A Hsp90 gátlása stresszválaszt provokál és a jelátviteli folyamatok zavarához vezet.
HSF-1, hősokk faktor 1
A Hsp90 a növekedési és differenciálódási jelpályák számos képviselőjével kölcsönhatásba lép (ld. Schnaider, 2000; ill. 2.8.2.1. fejezet). Nem csoda, hogy az
egyedfejlődés során mind a Hsp90 mennyisége, mind sejten belüli elhelyezkedése nagy változásokon megy keresztül. A petesejt érése és a korai embriogenezis során a Hsp90 mennyisége jelentősen megnő, a fehérje nagyobb része jut be a sejtmagba (Csermely és mtsai, 1998). A Hsp90 fejlődéssel és sejtciklussal összefüggő ingadozásában is szerepe lehet a hősokk faktoroknak (Nakai és Ishikawa, 2001). Annak ellenére, hogy a Hsp70-ről és más stresszfehérjék öregedésfüggő elváltozásaival számos közlemény foglalkozik, a Hsp90-ről nincs ilyen adat (összefoglalásul ld. Sőti és Csermely, 2000; 2002/a; 2000/b).
A Hsp90 minden szervben kifejeződik, az össz fehérjekészlet 1-3%-át alkotja.
Élesztőben a fenti mennyiségnek 15-öd része(!) is elegendő a normál hőmérsékleten történő növekedéshez, úgy tűnik tehát, hogy – legalábbis ebben az organizmusban – a természet pocsékol a Hsp90-nel (Xu és Lindquist, 1993). Döntően citoplazmatikus, de 5-6%-a a sejtmagban is megtalálható, ami – tekintetbe véve a Hsp90 nagy mennyiségét, – élettanilag is jelentős lehet (Schnaider, 2000). Hősokk hatására az eddig is tetemes (és felesleges?) fehérje mennyisége 3-10-szeresére nőhet, ami már tényleg luxusnak számít, tekintve, hogy – ismét élesztőben – a Hsp90 nem vesz részt a fehérjék hőaggregáció elleni védelmében (Nathan és mtsai, 1997). Ugyanakkor a szélsőséges hőmérsékleten való növekedéshez elengedhetetlen a masszív Hsp90 mennyiség (Borkovich és mtsai, 1989), de hogy mi lenne ennek a szerepe, az nem tisztázott. Mint említettem, a passzív chaperon hatás a Hsp90 oligomerizációját előidéző hőmérsékleten lép működésbe, feltehetően ekkor már olyan nagymennyiségű fehérje aggregálódik, aminek védelméhez nem elegendő az elsődleges dajkafehérjék (Hsp70, Hsp27) működése. Hősokk hatására a Hsp90 további 6-7% lassan, mindenféle sejtváz- és mozgatórendszeről függetlenül a sejtmagba vándorol (Akner és mtsai, 1992). A hőkezelés végeztével a Hsp90 visszavándorol a citoszolba, egy rákövetkező rövid hősokk hatására már nem figyelhető meg sejtmagi transzlokáció. Újkeletű az a tény, hogy hipoxia (Katschinski és mtsai, 2002) és az apoptotikus program (Gerner és mtsai, 2000) szintén a Hsp90 sejtmagi transzlokációjához vezetnek.
A vesekárosító kemoterapeutikum ciszplatin egyszeri injekciója a Hsp90 szelektív indukciójához és sejtmagi transzlokációjához vezet a vesecsatornácskák sejtjeiben. Az expresszálódó fehérjemennyiség és a transzlokáció az injekció utáni ötödik napon tetőzik, egybeesik a legintenzívebb regenerációs periódussal (Satoh és mtsai, 1994).
2.4. A Hsp90 általános szerkezeti vonásai 2.4.1. A Hsp90 domén-szerkezete
220
Buchner
Tripszin:
290
400
80
50 50
40
P P
P P
P P
P P 41
32/37 P 32/37
26/27 15
C C C C CC
C C C C CC
C C C C CC
C
C C C C CC
C C C C
Hartl
Nemoto
középső C-terminális N-terminális
ATP-kötés
töltött régió
dimerizáció
A B C
26/27
C C C CC
2.4.1. ábra A Hsp90 domén-szerkezete és triptikus fragmentumainak elhelyezkedése A három kutatócsoport által javasolt doménszerkezetek és a domének nevei felül láthatók. A ciszteineket C, a kazein kináz II által foszforilált helyeket P jelöli az elsődleges szekvenciában. A fő triptikus hasítási helyeket nyilak jelölik. A keletkezett fragmentumokat Lees-Miller és Anderson (1989/a), Nemoto és mtsai (1997), Hartson és mtsai (1999), Bogatcheva és mtsai (1999) és saját nem közölt eredményeink alapján állítottam össze. A fragmentumok feletti számokkal a relatív molekulatömegeket jelöltem.
A Hsp90 704-732 aminosavból épül fel (forrás: Swissprot). A továbbiakban – ha külön nem jelzem – a Hsp90 szekvenciáit az egyéb Hsp90 fehérjékhez illesztett humán Hsp90a(1- 731) szekvenciájára vonatkoztatva adom meg. Alakját tekintve elongált fehérje. Izoelektromos pontja 5,1-5,8, amit a fehérje változó foszforilációs állapota is befolyásol (átlagban 2-3 foszfát/monomer). Alapvetően dimer, azonban oligomerizációra hajlamos (ld. 2.7.3. fejezet).
Elektronmikroszkópos tanulmányok alapján a Hsp90 két doménből áll, melyeket egy flexíbilis csukló választ el egymástól lehetővé téve a domének kinyílását vagy becsukódását (Maruya és mtsai, 1999; ld. még 2.7.3.3.A ábra). Predikciós vizsgálatok és limitált proteolís alapján a
doménszerkezetről további finom részleteket deríthetünk ki (Lees-Miller és Anderson, 1989/a;
Nemoto és mtsai, 1997; Stebbins és mtsai, 1997; Sőti Cs., Csermely P., nem közölt eredmények; 2.4.1. ábra). A pontos doménfelépítésről megoszlanak a vélemények (ld. ábra).
Az N-terminális 25 kDa-os (1-220. as) és a C-terminális 60 kDa-os (300-610. as) domének között egy rendkívül töltött és flexibilis régió (töltött régió) helyezkedik el. Ha a Hsp90-et alacsony koncentrációjú tripszinnel hasítjuk, a töltött régió az N-terminális doménen marad. A nagy C-terminális domén a 614/617. aminosavnál könnyedén kettéhasad, a keletkező középső domén a 400. aminosavnál két szubdoménre válik szét. Az első töltött régión kívül még egy hasonló található a középső doménben (530-580. as).
2.4.2. A Hsp90 poszttranszlációs módosulása
A Hsp90 aminosav sorrendje különféle konszenzus motívumokat rejt (Binart és mtsai, 1989; Csermely és mtsai, 1998). Az N-kapcsolt glikozilációt csak az agyban előforduló, ismeretlen funkciójú Hsp90 homológ lektin esetén írták le (Chadli és mtsai, 1997).
Kimutatták, de ismeretlen a jelentősége a metilációnak és az ADP-ribozilációnak is (ld.
Schnaider, 2000). Tirozin foszforilációt eddig nem találtak, ezzel szemben számos szerin és treonin foszforilált. A Hsp90a N-terminálisát a kettősszálú DNS-függő protein kináz foszforilálja (Lees-Miller és Anderson, 1989/b). Mindkét izoformát foszforilálja a cAMP- függő protein kináz (Kudlicki és mtsai, 1985), a kazein kináz II (Lees-Miller és Anderson, 1989/a), és a szfingozin-függő kináz (Megidish és mtsai, 1999). A Hsp90 önmagát is képes – csekély hatásfokkal – autofoszforilálni (Csermely és Kahn, 1991).
A foszforiláció szerepe a Hsp90 működésében nagyrészt ismeretlen. A defoszforilált Hsp90 kevésbé képes az autofoszforilációra (Csermely és Kahn, 1991) és a v-src kináz kötésére (Mimnaugh és mtsai, 1995). A kazein kináz II általi foszforiláció szükséges az eIF2a- kináz natív funkcionális szerkezetének kialakításához (Szyszka és mtsai, 1989). Egy nemrég megjelent közleményben pedig bizonyították, hogy a Hsp90 reovírus sejten történő megtapadást közvetítő fehérjéje a Hsp90 szubsztrátja, és a chaperonról történő leválása egyszerre történik meg a Hsp90 foszforilációjával, bár az ok-okozati összefüggést nem bizonyították (Zhao és mtsai, 2001). A chaperon szerep és a foszforiláció közötti összefüggést támogatja az a megfigyelés is, hogy hősokk hatására a foszfátcsoportok forgalma felgyorsul a Hsp90-en (Legagneux és mtsai, 1991), valamint az, hogy a Hsp90-nel asszociáló, TPR-domént tartalmazó fehérjék között helyet kapott a PP5 foszfatáz is (ld. 2.7.2.3. táblázat). A jelátviteli folyamatokkal való kapcsolatot domborítja ki, hogy a plazmamebrán felől induló programozott
sejthalál során a Hsp90 foszforilálódik, és a sejtmagba transzlokálódik (Gerner és mtsai, 2000).
2.4.3. A Hsp90 fő immunogén régiói
A Hsp90 nemcsak aktívan, hanem antigénként is fontos szerepet játszik az immunrendszer működésben (ld. Csermely és mtsai, 1998). A Hsp90-ben két immunogén régió térképezhető fel (Nemoto és mtsai, 1997), melyek közül az első a töltött régió területére, a második a C-terminális legvégére (702-716. as) esik. Mindkettő az eukarióta Hsp90-ek szerzeménye. A Nemoto-labor eredményei (és predikciós adatok; Binart és mtsai, 1989) alapján azt hihetjük, hogy ezek az epitopok felületiek, annál is inkább, mert a töltött régió szinte nem tartalmaz hidrofób aminosavat. Nem szabad megfeledkezni azonban arról, hogy a szerzők rekombináns (E. coliban termelt) Hsp90-et használtak, melynek triptikus térképe és negyedleges szerkezete kissé eltér a tisztított fehérjéétől. A töltött régió bővelkedik lizinekben, a natív Hsp90-ben mégis csak a határán (283. as) hasítja a tripszin (Lees-Miller és Anderson, 1989/a; Hartson és mtsai, 1999; nem bemutatott adatok). Ez arra utalhat, hogy a töltött régió az intakt Hsp90 más részeivel lép kölcsönhatásba (ld. 2.6.2. fejezet), melyet egy nagy aviditású antitest természetesen képes megbontani. Ezt támogatja saját eredményeinken túl az a megfigyelés is, hogy a töltött régió területén található feltételezett nukleáris lokalizációs szignál csak a középső és a C-terminális domének deléciójával válik elérhetővé (Meng és mtsai, 1996, Jibard és mtsai, 1999).
A fenti fő immunogén régiókon túl két fontos anti-Hsp90 antitestet érdemes megemlíteni. Az első az AC88 antitest (Csermely és mtsai, 1998; Hartson és mtsai, 1999), melynek epitopja a 660-680. aminosavak által határolt régióban van, és kizárólag a szabad Hsp90-et ismeri fel. A másik az LKVIRK antitest, mely nevét az általa felismert 408-413.
aminosavak által határolt, rendkívül konzervált epitopról kapta. Az (auto)antitest képes kivédeni az invazív kandidázis által előidézett halálozást (Matthews és mtsai, 1991). Mindkét antitestnek nagy hasznát vettük kísérleteink során.
2.5. A Hsp90 doménjeinek elrendeződése
A Hsp90 nagy fehérje, doménjeinek többszörös intra- és intermolekuláris kölcsönhatásait számos szerkezeti és funkcionális tanulmány alátámasztja. A legalaposabb kutatásokat Takayuki Nemoto csoportja végezte, a HtpG fehérje szerkezetével kapcsolatosan.
Mivel modelljüket részben kísérleti eredmények, részben szerkezeti homológia alapján kiterjeszthetőnek vélik az eukarióta Hsp90 fehérjékre, ezért a kölcsönhatásban részt vevő szekvenciákat zárójelben a humán Hsp90 aminosav sorrendjére vonatkoztatva is megadom.
Nem szabad elfeledkeznünk arról, hogy a HtpG-ből hiányzik a töltött régió.
2.5.1. Intramolekuláris kölcsönhatás és chaperon funkció
A Nemoto-féle A-domén (2.4.1. ábra) második kétharmada, a 116-336. aminosavig (126-399) intramolekuláris kölcsönhatásba lép a B-domén 337-480. aminosavak által határolt B1 szubdoménjével (400-540). A kölcsönhatás, bár gyengébb, de konzervált a humán Hsp90a- ban is, sőt a prokarióta és eukarióta domének között hibrid komplex is létrehozható (Nemoto és mtsai, 2001/a). A kölcsönhatás hőlabilitása egyik tényezője lehet a HtpG/Hsp90 hő-indukált chaperon aktivitásának (Tanaka és mtsai, 2001).
2.5.2. Intermolekuláris kölcsönhatások a Hsp90 dimerben
Szintén Takayuki Nemoto laboratóriuma tárta fel a C-terminális domén dimerizációban játszott szerepét (Nemoto és mtsai, 1995; 2001/a). A HtpG B-domén 481-552. (541-607) aminosavig terjedő B2 szubdoménje antiparalel kölcsönhatást alakít ki a C-terminális utolsó 16 aminosavával (Nemoto és mtsai, 2001/a). Megjegyzendő, hogy a HtpG és a humán Hsp90a C-terminálisainak kölcsönhatása nem teljesen egyezik, HtpG-Hsp90 hibrid komplexek ez esetben nem hozhatók létre (Tanaka és mtsai, 2001). A különbség oka az, hogy az eukarióta Hsp90-ek középső és C-terminális doménjei jelentősen eltérnek a bakteriális homológokétól.
A humán Hsp90a C-terminális 49 aminosavának törlése gátolja a dimerizációt (Minami és mtsai, 1994), amihez a baktériumból hiányzó utolsó 35 aminosav feltehetően nem szükséges (Owen és mtsai, 2002). A 30 C-terminális aminosavat nélkülöző csirke Hsp90a mutáns más laborban nem dimerizált (Meng és mtsai, 1996). Jibard és mtsai (1999) tovább pontosították a Hsp90a B2 szubdoménjének azt a régióját, mely kölcsönhat a dimer másik felének C- terminális doménjével. Szerintük az 551-570. és a 664-680., valamint a 682-731. régiók vesznek részt a dimerizációban.
Prodromou és mtsai (1997/a) az élesztő Hsp90 N-terminális doménjének kristályszerkezetében dimer struktúrát találtak, bár mások ezt oldatban nem tudták kimutatni (Scheibel és mtsai, 1999/a). A dolog hátterében egyrészt az áll, hogy a diffrakciós képen megfigyelt dimer a kristályosítás során keletkező műtermék volt. Másrészt, a későbbiekben
szintén Prodromou és mtsai (2000) elegáns kísérletekkel alátámasztott tanulmányban közölték, hogy a dimerizációs tendencia csak ATP jelenlétében valósul meg. Eredetileg ugyanis a 101- 120. (114-133) aminosavak által határolt fedél régió az ATP-kötő zsebtől meglehetősen távol, a 19-27. (32-40) szegmentum által kihorgonyozva helyezkedik el, ATP hatására azonban feltehetően ráhajlik a zsebre, és elősegíti a Hsp90 N-terminális doménjének dimerizációját.
2.5.3. Feltételezhető domén-domén kölcsönhatások
Egyéb domén-domén kölcsönhatásokra csak indirekt bizonyítékok utalnak, minden esetre érdemes itt megemlíteni ezeket. A Hsp90 500-520. aminosavai egy feltételezett kalmodulin-kötő konszenzus szekvenciára emlékeztetnek. A Hsp90 Ca2+-kalmodulin kötésére képes (Minami és mtsai, 1993), melyet az 500-520. szekvenciájú megszintetizált peptid gátol, sőt maga köti a kalmodulint. Ennél is érdekesebb, hogy a peptid a Hsp90-nel is keresztköthető, és elősegíti az oligomerizációját. Feltételezhető, hogy ez a régió a molekula más részéhez köt, amelyet a Ca2+-kalmodulin vagy a hősokk felszabadít (ld. 2.6.2. fejezet).
Louvion és mtsai (1996) olyan domináns negatív Hsp90 mutánst találtak, mely az élesztő sejtek növekedését csak magasabb hőmérsékleten gátolja. Az 538-552. (558-572) aminosavak által határolt szegmentum a Hsp90 második töltött régiójában helyezkedik el, amely szerepet játszik a dimerizációban (Nemoto és mtsai, 1995, Jibard és mtsai, 1999).
Deléciója destabilizálhatja a dimerizációt, lévén az ebben résztvevő doménben található.
További bizonyíték erre az, hogy a domináns negatív hatást ozmotikus stabilizátorok (pl.
szorbitol) valamint a mutáns 652. (672) aminosaván túli régió eltávolítása kivédik (a 685.
[704] aminosavon túli deléció még nem védi ki). Az sem kizárható, hogy ebben a két régióban találhatóak a Hsp90 C-terminális ATP-kötőhelyének konszenzus motívumai (Csermely és Kahn, 1991; Callebaut és mtsai, 1994).
Bár konkrét szekvenciális adatok nem állnak rendelkezésre, egyértelműen bizonyított, hogy az N-terminális domén a fehérje többi részének működését nukleotidfüggően szabályozza (Sullivan és mtsai, 1997; Grenert és mtsai, 1997; 1999). A Hsp90 specifikus chaperon- működése in vitro és in vivo a teljes fehérje jelenlétét igényli (Scheibel és mtsai, 1999/b;
Johnson és mtsai, 2000). A töltött régió szintén befolyásolja az N- és C-terminális domének működését (Scheibel és mtsai, 1999/a; Johnson és mtsai, 2000; Bouhouche-Chatelier és mtsai, 2001), melyből fizikai kölcsönhatásra is következtethetünk, amint az N-terminális esetén Prodromou és mtsai (1997/a), a C-terminális esetén mi (Sőti és Csermely, 1998/a) felvetettük.
Ezekre a kölcsönhatásokra a C-terminális domén, illetve a teljes fehérje szerkezetének meghatározása deríthet fényt, az eddigi próbálkozások azonban nem eredményeztek nagyfelbontású röntgen diffrakciós képet (Prodromou és mtsai, 1997/a).
2.6. A Hsp90 doménjeinek finomszerkezete
2.6.1. Az N-terminális ATP-kötő domén
A B
2.6.1. ábra A Hsp90 ATP-kötő doménjének kristályszerkezete
A, a humán Hsp90a N-terminális doménjének ADP-komplexe oldalnézetből (PDB: 1BYQ) B, a humán Hsp90a N-terminális doménjének geldanamycin-komplexe felülnézetből (PDB: 1YET) Az ATP g-foszfátja nem ad diffrakciós árnyékot, a b-foszfát a zsebből kifelé mutat. A szerkezeteket a Chime program 2.03 verziójával jelenítettem meg.
Az N-terminális domént mind élesztőből, mind humán rekombináns Hsp90a-ból kristályosították (Prodromou és mtsai, 1997/a; 1997/b; Stebbins és mtsai, 1997; Obermann és mtsai, 1998). A domén konzervált aminosav sorrendje azonos harmadlagos szerkezetben jelenik meg. A domén olyan a/b-szendvics, melynek alja egy nyolcszálú folytonos, nagyrészt antiparalel b-redős lemezből áll, a falait felépítő kilenc hélix és összekötő hurkok pedig egy meglehetősen mély, hidrofób zsebet alakítanak ki (2.6.1. ábra). A zsebet vagy ADP, vagy geldanamycin, egy benzokinon anzamicin antibiotikum tölti ki, amely gátolja a Hsp90 ATP- kötését (Grenert és mtsai, 1997), ATPáz aktivitását, és in vivo funkcióját (Obermann és mtsai, 1998; Panaretou és mtsai, 1998).
2.6.1.1. A GHKL fehérjecsalád
Fehérje Típus Jelentőség N-terminális domén szerepe giráz B prokarióta topoizomeráz II osztódás DNS-kötés, hasítás koordináció topo II eukarióta topoizomeráz II sejtosztódás DNS-kötés, hasítás koordináció topo VI archeális topoizomeráz sejtosztódás DNS-kötés, hasítás koordináció MutL mismatch repair fehérje DNS hibajavítás DNS-MutS MutH összehozása CheA, EnvZ prokarióta hisztidin kináz prokarióta jelátvitel effektor fehérje foszforiláció
PDK, BCK eukarióta hisztidin kináz anyagcsere szabályozás a-ketosav dehidrogenázok foszforilációja JFC1 adapter fehérje(?) jelátvitel (?) lipid (PIP3)-fehérje kihorgonyzás(?) Hsp90 dajkafehérje chaperon kliens aktiváció koordinációja
2.6.1.1. táblázat A GHKL ATPáz/kináz szupercsalád tagjai
Szinte teljesen fedésbe hozható doménszerkezet figyelhető meg néhány fehérjénél, melyek egymástól látszólag teljesen eltérő elsődleges szerkezettel (<15% aminosav azonosság) és funkcióval rendelkeznek (2.6.1.1. táblázat). Közös vonásuk az, hogy működésük ATP- kötését és hidrolízisét igényli. Elsőként a DNS giráz B alegységének N-terminális doménjét egy ATP-analóg jelenlétében, dimerként kristályosították (Wigley és mtsai, 1991). Bergerat és mtsai (1997) ismerték fel, hogy az ATP-kötő motívumok más fehérjékben – köztük a Hsp90- ben és a MutL-ben – is megtalálhatók, így a szerkezetet Bergerat-típusú kötőhelynek nevezik.
Amerikai szerzők előnyben részesítik a betűszókat, a rokon fehérjék után (giráz, Hsp90, hisztidin kináz, MutL) a GHKL ATPáz/kináz szupercsalád nevet adományozták a családnak (Ban és mtsai, 1999; Dutta és Inouye, 2000). A családtagok száma fokozatosan gyarapodik, legújabb képviselői a mitokondriális a-ketosav dehidrogenázok kinázai (Machius és mtsai, 2001), illetve az egyelőre ismeretlen funkciójú, tandem C2 és SH3 doménekkel rendelkező JFC1 fehérje (Catz és mtsai, 2001).
2.6.1.2. Az ATP-kötés szerkezeti alapjai
Bár a Hsp90 és a giráz B N-terminálisa közötti szerkezeti hasonlóságot – egy bravúros CASP2 nyertes predikció segítségével – felismerték (Gerloff és mtsai, 1997), a kristályszerkezet (Prodromou és mtsai, 1997/b) és egyértelmű biokémiai bizonyítékok (Grenert és mtsai, 1997) ismeretéig a Hsp90 ATP-kötéséről, autofoszforilációs és ATPáz aktivitásáról,
