A Babesia vesperuginis filogenetikai vizsgálata

A Babesia vesperuginis az egyetlen olyan piroplasma, amelyről ismert, hogy denevéreket fertőz. Azt feltételezik, hogy – az emlősöket fertőző babesiák túlnyomó többségével szemben – nem kullancs, hanem óvantag (Argas vespertilionis) vektorral rendelkezik (Gardner és Molyneux, 1987). Nemrég két tanulmány is született a B. vesperuginis filogenetikai viszonyairól, és mindkettő alaphelyzetben mu-tatta a Babesia sensu stricto kládon belül (4.5.2. fejezet; Corduneanu és mtsai, 2017). Mindazonáltal, e korábbi törzsfákon nem szerepelt minden fontos piroplasma csoport, és/vagy csak egy génre (18S rRNS) épültek. Újabb vizsgálatunk célja tehát az volt, hogy első ízben nyerjünk cox1 szekvenciát a B.

vesperuginis hazai mintájából, és ezt megvizsgáljuk szélesebb filogenetikai összefüggésben.

Molekuláris módszerek: K, L Eredmények és megbeszélés

Ez a B. vesperuginis első, átfogó filogenetikai összehasonlítása, mely két génre épül. Vizsgálatunk során e piroplasma cox1 génjét először sikerült felerősíteni denevér óvantagokból (A. vespertilionis), illetve első alkalommal magyarországi mintából. Mind a négy, 18S rRNS gén PCR-ben pozitív minta azonos cox1 szekvenciát eredményezett. A B. vesperuginis cox1 szekvenciája (KY657243) legnagyobb hasonlóságot a Cytauxzoon felis cox1 szekvenciájával (KC207821) mutatott (79,1%, 709/896 bp), és kisebb volt a sensu stricto Babesia-fajok (ennek tartománya 74,9-77,6% volt a B. bigemina fajétól [AB499085] a B. canis fajéig [KX712138]) és a Theileria-fajok cox1 szekvenciáival (ami 74,2-77,5%-ig terjedt, a T. sinensis [JQ518293] és a T. luwenshuni [JQ518295] figyelembevételével). A cox1 szekvenciában talált hézagok száma maximum 10 illetve 14 volt a Babesia- illetve Theileria-fajokkal illesztve, míg nem volt hézag a C. felis fajjal összevetve. A B. vesperuginis és a B. conradae (nyugati Babesia csoport) cox1 szekvenciái közötti azonosság mindössze 73.2% (659/900 bp) volt, de ebben az összehasonlításban is csak két hézag volt.

Ez összhangban van a B. vesperuginis óvantagból nyert 18S rRNS gén szekvenciájának (KY657241) összehasonlító elemzésével: e tekintetben a hasonlóság legnagyobb fokú a "csoporton kívüli theileriák" közüli T. bicornis fajjal volt (AF499604: 422/455 bp = 92,7% azonosság); ezt követte a

"prototheilerida" B. conradae (AF158702: 416/450 bp = 92,4% azonosság) és a C. felis (AF399930:

409/450 bp = 90,9% azonosság) (szekvenciák és csoportnevek forrásai: Criado-Fornelio és mtsai, 2003b; Lack és mtsai, 2012; 4.8.3. fejezet). Másfelől, a B. vesperuginis 18S rRNS szekvenciája 90%-nál kisebb hasonlóságot mutatott a szűkebb értelemben vett Babesia- és Theileria-fajokkal. Az azonosság százalékának ebben a csökkenő sorrendjében a szekvencia hézagok száma relatíve kevés volt a T.

bicornis, B. conradae és C. felis fajokkal illesztve (10, 4 és 8), míg közepes (20-29) vagy sok (28–58) a Theileria- és Babesia-fajokkal összehasonlítva.

A filogenetikai vizsgálat során kapott törzsfák topológiája is jól tükrözte a fenti szekvencia hasonlóságokat és hézagszámokat. Nevezetesen, cox1 génje alapján a B. vesperuginis a babesia sensu stricto kategórián kívülre került (96% támogatottság mellett), közel a C. felis fajhoz és a theileriákhoz (4.2.4.1. ábra). Ha a C. felis fajt kihagytuk az elemzésből, a B. vesperuginis (a régebbi álláspontnak megfelelően) továbbra is a szorosabb értelemben vett babesiák filogenetikai csoportjába tartozott (nem közölt törzsfa). Ez egyértelműen jelzi, hogy a B. vesperuginis pontos rendszertani helyét definiálni hivatott filogenetikai vizsgálatokból nem szabad kihagyni sem a C. felis fajt, sem a fontosabb piro-plasma csoportok legalább néhány képviselőjét.

Az összefűzött (konkatenált) cox1 és 18S rRNS gén szekvenciák filogenetikai vizsgálata mindkét alkalmazott modellel hasonló topológiájú törzsfát eredményezett. Nevezetesen, a B. vesperuginis a klasszikus babesiáktól külön ágra került, magas támogatottsággal (4.2.4.2. ábra: 99%, 4.2.4.3. ábra:

88%). Ezen felül a B. vesperuginis vagy a "prototheilerida" B. conradae és a theileriák, C. felis alkotta filogenetikai csoport mellé került (4.2.4.2. ábra), vagy a B. conradae fajjal a Theileriidae család kládjának testvércsoportját alkotta (4.2.4.3. ábra).

4.2.4.1. ábra. A piroplasmák csoportjainak ML törzsfája a cox1 szekvenciák alapján. A vizsgálatban nyert szekvenciát inverz lila szín jelöli. Csoportok (Schreeg és mtsai, 2016 után): 1 = Babesia sensu stricto; 2 = Theileria sensu stricto és Cytauxzoon; 3 = nyugati Babesia csoport; 4 = Th. equi; 5 = Babesia microti csoport.

4.2.4.2. ábra. A piroplasmák csoportjainak (lásd 4.2.4.1. ábra) ML (GTR modell) törzsfája az összefűzött cox1, 18S rRNS szekvenciák alapján. A vizsgálatban nyert szekvenciát inverz lila szín jelöli.

A szóban forgó fajok morfológiai és fejlődéstani jellegzetességei alátámasztják a B. vesperuginis fenti filogenetikai viszonyait, tehát hogy közelebbi rokonságban van a theileriákkal, mint a babesiákkal, és legközelebbi rokona a C. felis és a B. conradae lehet. Konkrétan, bár a B. vesperuginis fejlődésmenetét egészében véve nem ismerjük, leírták, hogy léteznek négy magvú osztódó alakjai ("tetrádok") (Gardner és Molyneux, 1987). Ez emlékeztet arra, amit a C. felis (Glenn és mtsai, 1982) és a B. conradae (Kjemtrup és mtsai, 2006) fajok vonatkozásában említ a szakirodalom. Ezzel szemben, a Babesia sensu stricto csoport képviselőire a vörösvértestekben való kettéosztódás jellemző (Conrad és mtsai, 2006).

4.2.4.3. ábra. A piroplasmák csoportjainak ML (HKY modell) törzsfája az összefűzött cox1 és 18S rRNS szekvenciák alapján. A jelöléseket lásd 4.2.4.1. ábra.

Ismert, hogy a 18S rRNS gén széles körben elfogadott és alkalmazott genetikai marker a Piroplasmida rend képviselői közötti filogenetikai viszonyok feltérképezésében, és a csoport taxonómiájának tisztá-zását célzó tanulmányok nagy többsége is ezt vette figyelembe (Schreeg és mtsai, 2016). Azonban e marker szinte kizárólagos használata következetlenségekhez vezetett, mivel a filogenetikai vizsgálatok eredménye ellentmondó volt bizonyos Babesia- és Theileria-fajok elhelyezésében. Ezért a mitochond-rialis genom szekvenciáinak (amilyen a cox1) elemzése – a 18S rRNS gén mellett vagy azzal összefűzve – hasznosnak bizonyult a piroplasmák törzsfejlődési viszonyainak megállapításában, a taxonok elkülö-nítésében és az evolúciós viszonyok feltárásában (Gou és mtsai, 2012; Schreeg és mtsai, 2016).

Ez az első olyan, a fentiek szellemében végzett átfogó analízis, amelybe e különleges piroplas-mát, a B. vesperuginis fajt szintén bevették. Eredményünket későbbi tanulmányunk is igazolta (4.5.4.

fejezet). Összességében, a vizsgálatunk során kapott törzsfák azokat a filogenetikai viszonyokat tükrözik (tehát ugyanazon öt fő piroplasma csoport elkülönülését), amelyeket más szerzők nemrég a cox1 aminosav sorrendre vagy a konkatenált mitochondrialis + 18S rRNS gén nukleotid szekvenciákra épülő törzsfák esetében kaptak (Schreeg és mtsai, 2016).

Következtetésképpen, az elvégzett cox1 szekvencia összehasonlítások és törzsfa elemzések egyértelműen azt támasztják alá, hogy a B. vesperuginis – nevével ellentétben – nem tagja a szorosabb értelemben vett Babesia-fajok filogenetikai csoportjának, hanem külön ághoz tartozik, legközelebbi rokonságban a C. felis és a B. conradae fajokkal. Ennélfogva, a B. vesperuginis egyedülálló és taxonó-miailag fontos fajnak számít, amelynek szerepelnie kell a Piroplasmida rend filogenetikai viszonyainak átfogó vizsgálatát célzó tanulmányokban.