= ∑ d obs d pred d pred
6. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK/ TÉZISPONTOK
1. Tézis
Kicsapatásos - glutáraldehid keresztkötéses, emulziós - glutáraldehid keresztkötéses, és ionotrópos - glutáraldehid keresztkötéses eljárások változatait dolgoztam ki enzim rögzítésre alkalmas kitozán makrogömbök, mikrogömbök és nanorészecskék előállítására.
Megállapítottam, hogy a célra legalkalmasabbaknak a mikrogömbök bizonyultak.
1.1. A kicsapatásos - glutáraldehid keresztkötéses módszerrel porozitás nélküli, 3,2 mm-es átlag átmérőjű, szűk méreteloszlású makrogömböket állítottam elő. Megállapítottam, hogy az enzim kötés érdekében 1% és 5% glutáraldehiddel funkcionalizált makrogömbök az eljárás során megszilárdultak és törékenyebbé váltak.
1.2. A mikrogömbök előállítására három eljárást tanulmányoztam: porlasztásos-kicsapatást, amelyben kitozán oldatot porlasztottam egy kevertetett kicsapató reagensbe, folyamatos kevertetéses ionotrópos gélképzést és az emulziós keresztkötés módszerét.
Megállapítottam, hogy az emulziós keresztkötés a legmegfelelőbb módszer, mivel szűk méreteloszlást és nem agglomerálódó részecskéket kaptam. Az olajfázis összetételének, fajtájának és az emulgeálószer koncentrációjának megfelelő kiválasztásával 20 és 500 µm között, széles mérettartományban állítottam elő részecskéket. Az irodalomban leírt petroléter-paraffin olaj keverékét, környezetbarát napraforgóolaj–n-hexadekán keverékre cseréltem. Megállapítottam, hogy az adott körülmények között az előállított mikrorészecskék morfológiája és enzim rögzítés szempontjából is a 40% napraforgóolaj–
60% n-hexadekán olajfázis keveréke és 3% Tween 80 felületaktívanyag koncentráció bizonyult a legmegfelelőbbnek.
1.3. Nanoméretű kitozán részecskék előállítására az ionotrópos gélképzés módszert találtam a legalkalmasabbnak, majd a megszilárdítás és enzim kötés érdekében a nanorészecskéken glutáraldehides keresztkötést alkalmaztam. Kimutattam, hogy a gélképző ágens fajtája jelentősen befolyásolja az előállított nanorészecskék méretét:
nátrium-szulfáttal átlagosan 517 nm-es míg nátrium-tripolifoszfáttal 152 nm-es részecskéket kaptam.
(Kapcsolódó publikációk: [1], [4], [5], [9])
2. Tézis
A részecske előállítási folyamat változóinak a kitozán mikrorészecskék átlagméretére gyakorolt szignifikáns hatásait 4-faktoriális 3-szintes Box-Behnken kísérleti tervezéssel tanulmányoztam. Vizsgáltam a keverési sebesség, a Tween 80 felületaktívanyag koncentráció, a kitozán oldat koncentráció és a glutáraldehid koncentráció hatását az előállított részecskék méretére.
2.1. Megállapítottam, hogy nagy keresztkötő ágens koncentrációnál a keverési sebesség növelésével a megnövekedett diszperziós hatás következtében csökkent az elérhető átlagos részecskeméret. Alacsony keresztkötő ágens koncentrációnál a keverés ellentétes irányú hatása érvényesült, valószínűleg a kevésbé szilárd részecskék nagyobb összetapadási hajlama következtében.
2.2. Kimutattam, hogy a felületaktívanyag koncentráció növelése általában csökkentette a részecskék átlagméretét, de magasabb keresztkötő ágens koncentrációnál ez a hatás megszűnt, feltehetően a magasabb viszkozitás vagy a gyorsabban megszilárduló részecskék nehezebb apríthatósága következtében.
2.3. Megállapítottam, hogy a kitozán oldat koncentrációjának van a legjelentősebb hatása, és kimutattam, hogy az emulziós keresztkötéssel előállított részecske mérete annál kisebb minél magasabb a kitozán koncentráció értéke, valószínűleg annak következtében hogy magasabb koncentrációnál a kitozán cseppek gyorsabban megszilárdulnak és kevésbé hajlamosak az összetapadásra. Ebből arra következtettem, hogy a kitozán cseppek elsődleges szétdarabolódása után a kisebb összetapadási hajlam kisebb részecskéket eredményezett.
2.4. Bebizonyítottam, hogy az átlagos részecskeméretet második legjelentősebb hatásként a glutáraldehid koncentrációja befolyásolta, részben a részecskék keménysége, részben azok kisebb összetapadási hajlama következtében, amelyek emiatt szorosan összefüggésbe hozhatók más paraméterek értékeivel. Megállapítottam, hogy magas keverési sebességnél a glutáraldehid koncentráció csökkentése a részecskék átlagméretének hirtelen növekedését eredményezte, a nagyobb mértékű összetapadás következtében.
2.5. A kísérleti adatok statisztikai elemzése révén és nem-lineáris regresszió módszerével az átlagos szemcseméretnek a vizsgált technológiai paraméterek függvényében történő megjóslására elfogadható megbízhatósággal és átlagos hibával rendelkező statisztikus
matematikai modellt állítottam fel. Az egyenlet alkalmazhatónak bizonyult a technológiai paraméterek optimalizálására, abból a célból, hogy biokatalizátor hordozóként alkalmas átlagos szemcseméretű, kitozán mikrogömböket állíthassak elő.
(Kapcsolódó publikációk: [2], [10], [11])
3. Tézis
Immobilizálási vizsgálataim alapján kimutattam, hogy a β-D-galaktozidáz kovalens rögzítésére a kitozán mikrogömbök bizonyultak legalkalmasabb potenciális hordozóknak, glutáraldehidet használva keresztkötő ágensként. A rögzítést befolyásoló fő tényezők vizsgálata révén az adott körülmények között legmegfelelőbb technológiai paraméterekre a következő megállapításokat tettem:
3.1. Kimutattam, hogy 2%-os és 3%-os glutáraldehid koncentráció hasonló rögzítési hatékonyságot eredményezett, de az utóbbi (3%) koncentrációt választottam, mivel a kisebb szemcseméret és a részecskék magasabb fajlagos felülete következtében ez több kapcsolódási helyet biztosíthat a részecskéken.
3.2. Megállapítottam, hogy a 3%-os glutáraldehiddel keresztkötött kitozán mikrorészecskék 27 mg fehérje/ g száraz hordozó kötési kapacitással rendelkeztek.
3.3. Kimutattam, hogy a kitozán mikrorészecskékre kötött enzim kapcsolásának legmegfelelőbb reakció ideje 6 óra, mivel ez alatt az idő alatt értem el a kötésre vitt enzimatikus aktivitás visszanyerésének maximális értékét.
3.4. Megállapítottam, hogy az adott körülmények között legmegfelelőbb esetben, 3,7 mg kötésre vitt fehérje per 1 g vizes kitozán szemcse értéknél, a fehérje rögzítés hatásfoka elérte a 99%-ot és a kötésre vitt enzimatikus aktivitás visszanyerési hozama a 13,06%-ot.
A kovalens kötést követően, a Schiff bázisok nátrium-borohidrides redukciója rugalmasabb és stabilabb amino kötéseket eredményezve, csaknem kétszeresére növelte a katalitikus hatékonyságot. Így a kötésre vitt aktivitás visszanyerése 23,5%-ra nőtt, ami elfogadható eredmény a kovalens kötés esetében.
(Kapcsolódó publikációk: [1], [3], [8], [12])
4. Tézis
A β-D-galaktozidázt rögzítettem kovalensen kötött alkil csoportokat tartalmazó szerves-szervetlen kompozit mátrixokba szol-géles bezárással vagy szol-gél bezárásos-adszorpciós kombinált módszerrel. Ezen tanulmányaim során nanoszerkezetű biokatalizátorokat állítottam elő magas rögzítési hozammal és aktivitással.
4.1. Kimutattam, hogy a tanulmányozott szilán prekurzorok közül a tetraetoxiszilán és metiltrietoxiszilán 7:1 mólarányával rögzített β-D-galaktozidáz mutatta a legmagasabb aktivitást 3252,78 µmol ONP×min-1×g-1, 6,22 mg fehérje per mmol szilán prekurzor kötésre vitt enzim tartalom mellett.
4.2. A legmagasabb rögzítési hatásfokot ennél alacsonyabb, 4,1 mg fehérje per mmol szilán kötésre vitt enzim tartalomnál értem el, amely 400%-nál magasabb kötésre vitt aktivitás visszanyerési hozamot eredményezett. Ez a magas hozam azt mutatja, hogy a nanoszerkezetű szol-gél mátrixban az enzim aktivitása növekedett a bezárást követően.
Ennek lehetséges magyarázata az, hogy az enzim egyenletesebben oszlik el a porózus mátrix belsejében, megakadályozva a biomolekulák aggregálódását és a mátrix belső mikrokörnyezete megvédi az enzimet az inaktiválódási hatásokkal szemben.
4.3. A szol-géles bezárás módszerét adszorpcióval kombináltam és azt tapasztaltam, hogy a legjobb katalitikus hatásfokot kitozán adszorbens használatával értem el. Az így nyert aktivitás nagyon közeli értéket mutatott a szimpla szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidáz aktivitásával (körül-belül 3300 enzimatikus egység per g hordozó).
5. Tézis
A kovalens kötés és szol-géles bezárás módszerével előállított rögzített β-D-galaktozidáz biokatalizátorok tulajdonságai vizsgáltam. Tanulmányoztam pH függésüket, hőmérséklet, működési és tárolási stabilitásukat.
5.1. Megállapítottam, hogy a kovalensen kötött β-D-galaktozidáz a natív enzimhez viszonyítva kissé stabilabbnak mutatkozott magasabb pH értékeken, pH 9-en 50% körüli remanens aktivitást mutatva. A szol-gélbe zárt enzim kitűnő stabilitással rendelkezett bázikus pH értékeken, pH 11-en az aktivitása 90%-át őrizte meg a pH 8,5-ön tapasztalt maximális értékhez viszonyítva.
5.2. A szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidáz esetében láthatólag jobb hőstabilitást mutattam ki a natív és a kovalensen kötött enzimekhez viszonyítva. A szol-géles heterogén biokatalizátor inaktiválódását csak 60ºC-on 8 óra inkubálás után tapasztaltam, míg a natív enzim 40ºC-on 3 óra után aktivitásának 50%-át elveszítette.
5.3. A laktóz hidrolízis kinetikai vizsgálatával meghatároztam a Michaelis állandókat (Km) és a következő értékeket kaptam: 140,7 mM a kovalensen kötött, 123,7 mM a szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidázra, valamint 84,4 mM a nem-rögzített enzimre. Megállapítottam, hogy a laktóz iránti specificitás csökkenés valószínűleg a magasabb anyagátadási ellenállás és diffuziós gátlás miatt következett be, amely rendszerint fellép a rögzített enzimek alkalmazásánál.
5.4. Kimutattam, hogy a szol-gélbe rögzített enzim magas tárolási és elfogadható működési stabilitással rendelkezett. Öt újrafelhasználási ciklus után az aktivitás 50% körüli értéket mutatott az eredeti aktivitáshoz képest.
7. REFERENCES
Adlercreutz P. (1991) On the importance of the support material for enzymatic synthesis in organic media. Eur. J. Biochem. 199, 609-614.
Afrin R., Haruyama T., Yanagida Y., Kobatake E., Aizawa M. (2000) Catalytic activity of Teflon particle-immobilized protease in aqueous solution. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 9, 259-267.
Agarwal S., Wendorff J.H., Greiner A. (2010) Chemistry on electrospun polymeric nanofibers: merely routine chemistry or a real challenge? Macromol. Rapid Commun.
31, 1317-1331.
Alderliesten M. (1991) Mean Particle Diameters Part II: Standardization of Nomenclature, Particles and Particle System Characterization, Volume 8, 237-241.
Ansari S.A., Husain Q. (2012) Potential applications of enzymes immobilized on/in nanomaterials: A review. Biotechnol Adv. 30, 512-523.
Ardao I., Alvaro G., Benaiges M.D. (2011) Reversible immobilization of rhamnulose-1-phosphate aldolase for biocatalysis: Enzyme loading optimization and aldol addition kinetic modeling. Biochem. Eng. J. 56, 190-197.
Arica M.A., Yavuz H., Patir S., Denizli A. (2000) Immobilization of glucoamylase onto spacer-arm attached magnetic poly(methylmethacrylate) microspheres:
characterization and application to a continuous flow reactor. J. Mol. Cat. B:
Enzymatic, 11, 127-138.
Ariga O., Suzuki T., Sano Y., Murakami Y. (1996) Immobilization of a thermostable enzyme using a sol-gel preparation method. J. Ferment.Bioeng. 82, 341-345.
Ateş S., Mehmetoğlu Ü. (1997) A new method for immobilization of β-galactosidase and its utilization in a plug flow reactor. Process Biochem. 32, 433-436.
Ayhan F., Ayhan H., Pişkin E., Taniolac A. (2002) Optimization of urease immobilization onto non-porous HEMA incorporated poly(EGDMA) microbeads and estimation of kinetic parameters. Bioresour. Technol. 81, 131-140.
Azevedo A.M., Cabral J.M.S., Gibson T.D., Fonseca L.P. (2004) Operation and performance of analytical packed-bed reactors with an immobilised alcohol oxidase. J.
Mol. Cat. B: Enzymatic, 28, 45-53.
Bahar T., Celebi S.S. (1998) Characterization of glucoamylase immobilized on magnetic poly(styrene) particles. Enzyme Microb. Technol. 23, 301-304.
Bahar T., Celebi S.S. (2000) Performance of immobilized glucoamylase in a magnetically stabilized fluidized bed reactor (MSFBR). Enzyme Microb. Technol. 26, 28-33.
Bahar T., Celebi S.S. (1999) Immobilization of glucoamylase on magnetic poly(styrene) particles. J. Appl. Polym. Sci. 72, 69-73.
Bakken A.P., Hill C.G.Jr., Amundson C.H. (1990) Use of novel immobilized beta-galactosidase reactor to hydrolyze the lactose constituent of skim milk. Biotechnol.
Bioeng. 36, 293-309.
Bakken A.P., Hill C.G.Jr., Amundson C.H. (1992) Hydrolysis of lactose in skim milk by immobilized β-galactosidase (Bacillus circulans). Biotechnol. Bioeng. 39, 408-417.
Bayramoğlu G., Kiralp S., Yilmaz M., Toppare L., Arica M.Y. (2008) Covalent immobilization of chloroperoxidase onto magnetic beads: Catalytic properties and stability. Biochem. Eng. J. 38, 180-188.
Bayramoğlu G., Tunali Y., Arica M.Y. (2007) Immobilization of β-galactosidase onto magnetic poly(GMA–MMA) beads for hydrolysis of lactose in bed reactor. Catal.
Commun. 8, 1094-1101.
Becerra M., Baroli B., Fadda A.M., Blanco Méndez J., González Siso M.I. (2001) Lactose bioconversion by calcium-alginate immobilization of Kluyveromyces lactis cells.
Enzyme Microb. Technol. 29, 506-512.
Becerra M., Cerdán E., González Siso M.I. (1998) Micro-scale purification of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis reveals that dimeric and tetrameric forms are active. Biotechnol. Techniques, 12, 253-256.
Bélafi-Bakó K. (2006) Effect of operation conditions on the efficiency of membrane bioreactors. Desalination, 200, 511-513.
Berensmeier S., Ergezinger M., Bohnet M., Buchholz K. (2004) Design of immobilised dextransucrase for fluidised bed application. J. Biotechnol. 114, 255-267.
Berthold A., Cremer K., Kreuter J. (1996) Preparation and characterization of chitosan microspheres as drug carrier for prednisolone sodium phosphate as model for anti-inflammatory drugs. J. Control. Release, 39, 17-25.
Betancor L., Berne C., Luckarift H.R., Spain J.C. (2006) Coimmobilization of a redox enzyme and a cofactor regeneration system. Chem. Commun. 3640-3642.
Betancor L., Luckarift H.R., Seo J.H., Brand O., Spain J.C. (2008) Three-dimensional immobilization of β-galactosidase on a silicon surface. Biotechnol. Bioeng. 99, 261-267.
Beysseriat M., Decker E.A., McClements J.D. (2006) Preliminary study of the influence of dietary fiber on the properties of oil-in-water emulsions passing through an in vitro human digestion model. Food Hydrocolloids, 20, 800-809.
Biaikowska A.M., Ciemlijski H., Nowakowska K.M., Kur J., Turkiewicz M. (2009) A new β-galactosidase with a low temperature optimum isolated from the Antarctic Arthrobacter sp. 20B: gene cloning, purification and characterization. Arch.
Microbiol. 191, 825-835.
Biermann L., Glantz M.D. (1968) Isolation and characterization of β-galactosidase from Saccharomyces lactis. Biochim. Biophys. Acta-Enzymology, 167, 373-377.
Boller T., Meier C., Menzler S. (2002) EUPERGIT oxirane acrylic beads: How to make enzymes fit for biocatalysis. Org. Process Res. Dev. 6, 509-519.
Bommarius A.S., Riebel B.R. (2004) Biocatalysis, Wiley-VCH, Wienheim.
Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Brady D., Jordaan J. (2009) Advances in enzyme immobilisation. Biotechnol. Lett. 31, 1639-1650.
Braiuca P., Ebert C., Basso A., Linda P., Gardossi L. (2006) Computational methods to rationalize experimental strategies in biocatalysis, Trends Biotechnol. 24, 419-425.
Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T. (2005) Biocatalysts and enzyme technology, Wiley-VCH, Weinheim.
Budriene S., Gorochovceva N., Romaskevic T., Yugova L.V., Miezeliene A., Dienys G., Zubriene A. (2005) β-Galactosidase for Penicillium canescens. Properties and immobilization. Cent. Eur. J. Chem. 3, 95-105.
Cabrera-Padilla R.Y., Lisboa M.C., Fricks A.T., Franceschi E., Lima A.S., Silva D.P., Soares C.M.F. (2012) Immobilization of Candida rugosa lipase on poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate): a new eco-friendly support. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 39, 289-298.
Cao L. (2005a) Immobilised enzymes: science or art? Curr. Opin. Chem. Biol. 9, 217-226.
Cao L. (2005b) Carrier-bound immobilized enzymes, Wiley-VCH, Weinheim.
Carrara C.R., Rubiolo A.C. (1994) Immobilization of β-galactosidase on chitosan.
Biotechnol. Prog. 10, 220-224.
Castelvetro V., De Vita C. (2004) Nanostructured hybrid materials from aqueous polymer dispersions. Adv. Coll. Interface Sci. 108-109, 167-185.
Cavaille D., Combes D. (1995) Characterization of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis. Biotechnol. Appl. Biochem. 22, 55-64.
Chen W., Chen H., Xia Y., Zhao J., Tian F., Zhang H. (2008) Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J. Dairy Sci. 91, 1751-1758.
Chen J.-P., Su D.-R. (2001) Latex particles with thermo-flocculation and magnetic properties for immobilization of alpha-chymotrypsin. Biotechnol. Prog. 17, 369-375.
Chibata I. (1978) Immobilized enzymes, research and development, John Wiley&Sons/Halsted Press, New York, 22-23.
Chiu S.-H., Chung T.-W., Giridhar R., Wu W.-T. (2004) Immobilization of β-cyclodextrin in chitosan beads for separation of cholesterol from egg yolk. Food Res. Int. 37, 217-223.
Chockchaisawasdee S., Athanasopoulos V.I., Niranjan K., Rastall R.A. (2005) Synthesis of galacto-oligosaccharide from lactose using β-galactosidase from Kluyveromyces lactis:
Studies on batch and continuous UF membrane-fitted bioreactors. Biotechnol. Bioeng.
89, 434-443.
Crescimbeni M.C., Nolan V., Clop P.D., Marin G.N., Perillo A. (2010) Activity modulation and reusability of β-D-galactosidase confined in sol-gel derived porous silicate glass. Coll. Surface B, 76, 387-396.
Datta S., Christena L.R., Rajaram Y.R.S.R. (2012) Enzyme immobilization: an overview on techniques and support materials. 3 Biotech, DOI: 10.1007/s13205-012-0071-7.
Deere J., Magner E., Wall J.G., Hodnett B.K. (2003) Adsorption and activity of proteins onto mesoporous silica. Cat. Lett. 19-23.
Demir N., Acar J., Sarioğlu K., Mutlu M. (2001) The use of commercial pectinase in fruit juice industry. Part 3: immobilized pectinase for mash treatment. J. Food Eng. 47, 275-280.
Demirel D., Özdural A.R., Mutlu M. (2004) Preparation and characterization of magnetic duolite-polystyrene composite particles for enzyme immobilization. J. Food Eng. 62, 203-208.
Denkbas E.B., Odabasi M. (2000) Chitosan microspheres and sponges: Preparation and characterization. J. Appl. Polym. Sci. 76, 1637-1643.
Dickson R.C., Dickson L.R., Markin J.S. (1979) Purification and properties of an inducible beta-galactosidase isolated from the yeast Kluyveromyces lactis. J. Bacteriol. 137, 51-61.
Dwevedi A., Kayastha A.M. (2009) Optimal immobilization of β-galactosidase from Pea (PsBGAL) onto Sephadex and chitosan beads using response surface methodology and its applications. Bioresour. Technol. 100, 2667-2675.
Dyal A., Loos K., Noto M., Chang S.W., Spagnoli C., Shafi K., Ulman A., Cowman M., Gross R.A. (2003) Activity of Candida rugosa lipase immobilized on γ-Fe2O3
magnetic nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 1684-1685.
Elnashar M.M.M., Yassin M.A. (2009) Lactose hydrolysis by β-galactosidase covalently immobilized to thermally stable biopolymers. Appl. Biochem. Biotechnol. 159, 426-437.
End N., Schöning K.-U. (2004) Immobilized catalysts in industrial research and application, in Topics in Current Chemistry, Volume 242, Immobilized catalysts. Solid phases, immobilization and applications (Kirschning A., Ed.), Springer-Verlag, Berlin, 273-317.
Fang Y., Huang X.-J., Chen P.-C., Xu Z.-K. (2011) Polymer materials for enzyme immobilization and their application in bioreactors. BMB Reports, 44, 87-95.
Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K., Gubicza L. (2007) On the background of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids. Biochem. Soc. Trans. 35, 1624-1627.
Fernandez-Lafuente R. (2009) Stabilization of multimeric enzymes: Strategies to prevent subunit dissociation. Enzyme Microb. Technol. 45, 405-418.
Fernández-Lorente G., Betancor L., Carrascosa A.V., Guisán J.M. (2011) Release of omega-3 fatty acids by the hydrolysis of fish oil catalyzed by lipases immobilized on hydrophobic supports. J. Am. Oil. Chem. Soc. 88, 1173-1178.
Fischel-Ghodsian F., Brown L., Mathiowitz E., Brandenburd D., Langer R. (1988) Enzymatically controlled drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2403-2406.
Flick E.W. (1991) Cosmetics additives, Noyes Publications, Park Ridge, New Jersey.
Furukawa S.Y., Kawakami K. (1998) Characterization of Candida rugosa lipase entrapped into organically modified silicates in esterification of menthol with butyric acid. J.
Ferment. Bioeng. 85, 240-242.
Gailliez-Degremont E., Bacquet M., Laureyns J., Morcellet M. (1997) Polyamines adsorbed onto silica gel: A Raman microprobe analysis. J. Appl. Polym. Sci. 65, 871-882.
Gan Q., Wang T., Cochrane C., McCarron P. (2005) Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery. Colloid. Surface B, 44, 65-73.
Gaur R., Pant H., Jain R., Khare S.K. (2006) Galacto-oligosaccharide synthesis by immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase. Food Chemistry, 97, 426-430.
Gekas V., Lopez-Leiva M. (1985) Hydrolysis of lactose: a literature review. Process Biochem. 20, 2-12.
Giacomini C., Villarino A., Franco-Fraguas L., Batista-Viera F. (1998) Immobilization of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis on silica and agarose: comparison of different methods. J Mol Cat. B:Enzymatic, 4, 313-327.
Godjevargova T., Nenkova R., Dimova N. (2005) Covalent immobilization of glucose oxidase onto new modified acrylonitrile copolymer/silica gel hybrid supports.
Macromol. Biosci. 5, 760-766.
Godjevargova T., Nenkova R., Konsulov V. (2006) Immobilization of glucose oxidase by acrylonitrile copolymer coated silica supports. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 38, 59-64.
Goncalves J.A., Castillo F.J. (1982) Partial purification and characterization of β-D-galactosidase from Kluyveromyces marxianus. J. Dairy Sci. 65, 2088-2094.
Górecka E., Jastrzębska M. (2011) Immobilization techniques and biopolymer carriers.
Biotechnol. Food Sci. 75, 65-86.
Greenberg N.A., Mahoney R.R. (1982) Production and characterization of β-galactosidase from Streptococcus thermophilus. J. Food Sci. 47, 1824-1835.
Guisán J.M. (Ed.) (2006) Methods in Biotechnology, Volume 22. Immobilization of enzymes and cells, 2nd Edition, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Guisán J.M. (1988) Aldehyde-agarose gels as activated supports for immobilization-stabilization of enzymes. Enzyme Microb. Technol. 10, 375-382.
Gupta M.N., Kaloti M., Kapoor M., Solanki K. (2011) Nanomaterials as matrices for enzyme immobilization. Artif. Cells Blood Substuit. Biotechnol. 39, 98-109.
Hsieh H.-J., Liu P.-C., Liao W.-J. (2000) Immobilization of invertase via carbohydrate moiety on chitosan to enhance its thermal stability. Biotechnol. Lett. 22, 1459-1464.
Hu B., Pan J., Yu H.-L., Liu J.-W., Xu J.-H. (2009) Immobilization of Serratia marcescens lipase onto amino-functionalized magnetic nanoparticles for repeated use in enzymatic synthesis of Diltiazem intermediate. Process Biochem. 44, 1019-1024.
Huckel M., Wirth H.-J., Hearn M.T.W. (1996) Porous zirconia: a new support material for enzyme immobilization. J. Biochem. Biophys. Methods, 31, 165-179.
Husain Q. (2010) β-Galactosidases and their potential applications: a review. Crit. Rev.
Biotechnol. 30, 41-62.
Illanes A. (Ed.) (2008) Enzyme biocatalysis, Springer Science + Business Media, Heidelberg.
Iso M., Chen B., Eguchi M., Kudo T., Shrestha S. (2001) Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 16, 53-58.
Iyer P.V., Ananthanarayan L. (2008) Enzyme stability and stabilization – Aqueous and non-aqueous environment. Proc. Biochem. 43, 1019-1032.
Jia H., Zhu G., Vugrinovich B., Kataphinan W., Reneker D.H., Wang P. (2002) Enzyme-carrying polymeric nanofibers prepared via electrospinning for use as unique biocatalysts. Biotechnol. Progress, 18, 1027-1032.
Jia H., Zhu G., Wang P. (2003) Catalytic behaviours of enzymes attached to nanoparticles:
the effect of particle mobility. Biotechnol. Bioeng. 84, 406-414.
Jochems P., Satyawali Y., Diels L., Dejonghe W. (2011) Enzyme immobilization on/in polymeric membranes: status, challenges and perspectives in biocatalytic membrane reactors (BMRs). Green Chem. 13, 1609-1623.
Juajun O., Nguyen T.-H., Maischberger T., Iqbal S., Haltrich D., Yamabhai M. (2011) Cloning, purification, and characterization of β-galactosidase from Bacillus licheniformis DSM 13. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 645-654.
Kamori M., Yamashita Y., Naoshima Y. (2002) Enzyme immobilization utilizing a porous ceramics support for chiral synthesis. Chirality, 14, 558-561.
Kemény S., Deák A. (2000) Design and Analysis of Experiments, Műszaki Kiadó, Budapest (in Hungarian).
Kennedy J.F., Cabral J.M.S. (1987) Production of modified and synthetic enzymes, in Biotechnology, Volume 7a, Enzyme technology (Rehm H.J, Reed G, Eds.), Wiley-VCH, Weinheim, 347-404.
Kennedy J.F., Cabral J.M.S. (1985) Immobilization of biocatalysts by metal-link/chelation process, in Immobilized enzymes and cells: a practical approach (J. Woodward, Ed.), IRL Press, Oxford, 19-38.
Kheirolomoon A., Khorasheh F., Fazelinia H. (2002) Influence of external mass transfer limitation on apparent kinetic parameters of penicillin G acylase immobilized on nonporous ultrafine silica particles. J. Biosci. Bioeng. 93, 125-129.
Kim B.C., Nair S., Kim J., Kwak J.H., Grate J.W., Kim S.H., Gu M.B. (2005) Preparation of biocatalytic nanofibres with high activity and stability via enzyme aggregate coating on polymer nanofibres. Nanotechnology, 16, S382, doi:10.1088/0957-4484/16/7/011.
Kim J., Grate J.W., Wang P. (2006) Nanostructures for enzyme stabilization. Chem. Eng.
Sci. 61, 1017-1026.
Kim Y.-S., Park C.-S., Oh D.-K. (2006) Lactulose production from lactose and fructose by a thermostable β-galactosidase from Sulfolobus solfataricus.Enzyme Microb. Technol.
39, 903-908.
Klibanov A. M. (1983) Immobilized enzymes and cells as practical catalysts. Science, 219, 722-727.
Klinkesorn U., Namatsila Y. (2009) Influence of chitosan and NaCl on physicochemical properties of low-acid tuna oil-in-water emulsions stabilized by non-ionic surfactant.
Food Hydrocolloids, 23, 1374-1380.
Kondo A., Fukuda H. (1997) Preparation of thermo-sensitive magnetic hydrogel microspheres and application to enzyme immobilization. J. Ferment. Bioeng. 84, 337-341.
Koneracká M., Kopčanský P., Timko M., Ramchand C.N., De Sequeira A., Trevan M.
(2002) Direct binding procedure of proteins and enzymes to fine magnetic particles. J.
Mol. Cat. B: Enzymatic, 18, 13-18.
Kotha A., Raman R.C., Ponrathnam S., Kumar K.K., Shewale J.G. (1996) Beaded reactive polymers, 2. Immobilization of penicillin G acylase on glycidyl methacrylate-divinyl benzene copolymers of differing pore size and its distribution. React. Funct. Polym.
28, 235-242.
Krajewska B. (2004) Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme Microb. Technol. 35, 126-139.
Kulshrestha Y., Husain Q. (2006) Direct immobilization of peroxidase on DEAE cellulose from ammonium sulphate fractionated proteins of bitter gourd (Momordica charantia).
Enzyme Microb. Technol. 38, 470-477.
Kumari A., Kayastha A.M. (2011) Immobilization of soybean (Glycine max) α-amylase onto chitosan and AmberliteMB-150 beads: optimization and characterization. J. Mol.
Cat. B: Enzymatic, 69, 8-14.
Ladero M., Santos A., Garcia-Ochoa F. (2000) Kinetic modeling of lactose hydrolysis with
Ladero M., Santos A., Garcia-Ochoa F. (2000) Kinetic modeling of lactose hydrolysis with