uropathogenic Escherichia coli

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Necrosis is the dominant cell death pathway in uropathogenic Escherichia coli elicited epididymo-orchitis and is responsible for damage of rat testis

Necrosis is the dominant cell death pathway in uropathogenic Escherichia coli elicited epididymo-orchitis and is responsible for damage of rat testis

Male infertility is a frequent medical condition, compromising approximately one in twenty men, with infections of the reproductive tract constituting a major etiological factor. Bacterial epididymo-orchitis results in acute inflammation most often caused by ascending canalicular infections from the urethra via the continuous male excurrent ductal system. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) represent a relevant pathogen in urogenital tract infections. To explore how bacteria can cause damage and cell loss and thus impair fertility, an in vivo epididymo-orchitis model was employed in rats by injecting UPEC strain CFT073 into the vas deference in close proximity to the epididymis. Seven days post infection bacteria were found predominantly in the testicular interstitial space. UPEC infection resulted in severe impairment of spermatogenesis by germ cell loss, damage of testicular somatic cells, a decrease in sperm numbers and a significant increase in TUNEL (+) cells. Activation of caspase-8 (extrinsic apoptotic pathway), caspase-3/26 (intrinsic apoptotic pathway), caspase-1 (pyroptosis pathway) and the presence of 180 bp DNA fragments, all of which serve as indicators of the classical apoptotic pathway, were not observed in infected testis. Notably, electron microscopical examination revealed degenerative features of Sertoli cells (SC) in UPEC infected testis. Furthermore, the passive release of high mobility group protein B1 (HMGB1), as an indication of necrosis, was observed in vivo in infected testis. Thus, necrosis appears to be the dominant cell death pathway in UPEC infected testis. Substantial necrotic changes seen in Sertoli cells will contribute to impaired spermatogenesis by loss of function in supporting the dependent germ cells.
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Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) cause impairment of spermatogenesis by inducing programmed necrosis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) cause impairment of spermatogenesis by inducing programmed necrosis

the seminiferous tubules could induce a detrimental effect on spermatogenesis [190]. These conflicting observations indicate distinct mechanisms may be involved in different infection models. Systemic and local inflammatory responses can be mounted by intraperitoneal LPS injection that subsequently affects testicular function [32,45]. However, the immune response evoked by dead bacteria or LPS within the seminiferous tubules appears to play little role in spermatogenic impairment when the germinal epithelium is directly exposed to E. coli. In agreement with the observations of Nagaosa and colleagues, my findings showed that the NPEC 470 strain expressing LPS did not decrease viability in SC and PTC (Figure 15). Therefore, other virulence factors produced by living UPEC such as secreted soluble toxins are assumed to contribute to the death of infected testicular cells. Another study on a pore-forming toxin described a series of cell death cascades which is similar to my observations in UPEC infected SC and PTC [176]. As an important virulence factor thoroughly characterized, an E. coli pore-forming toxin HlyA is able to induce Ca 2+ influx and manipulate cell death in various target cells [238]. By employing various E. coli strains, it was revealed that only those strains with HlyA encoding sequence were able to induce SC and PTC death (Figure 15). Furthermore, HlyA (+) E. coli strains caused phosphatidylserine exposure and plasma membrane disintegration in infected SC and PTC (Figure 16). Therefore, HlyA appears to be a primary candidate contributing to the pathogenesis of UPEC infection causing damage within the testis and inducing programmed necrosis in SC and PTC. Future studies need to investigate if blocking the binding of HlyA to cell membrane can abolish the lethal effect of UPEC on target cells.
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The role of cytotoxic necrotizing factor 1-induced activation of RhoG during uropathogenic Escherichia coli infections

The role of cytotoxic necrotizing factor 1-induced activation of RhoG during uropathogenic Escherichia coli infections

Additionally, many bacterial protein toxins have been described to modulate members of the Rho family of small GTPases by divers covalent modifications. Activation of Rac1, RhoA and Ccd42 is induced by deamidation (E. coli/Yersinia CNFs, Bordetella spp. Dnt), transglutamination (Bordetella spp. Dnts) or ADP-ribosylation (P. luminescence TccC5). Much more pathogens cause inactivation of Rac1, RhoA and Cdc42 by glycosylation (C. difficile toxins A and B, C. sordellii hemorrhagic toxin), adenylylation (V. parahaemolyticus VopS, H. somni IbpA) or proteolytic cleavage (P. luminescence LopT, Yersinia spp. YopT) (Aktories, 2011). However, bacterial toxins have never been reported to covalently modify RhoG. Thus, our finding that CNF1 is able to deamidate RhoG provokes the question whether RhoG may also be a substrate for another deamidating toxin, Dnt. Dnt was found to have an important but somewhat undefined role as virulence factor in Bordetella pathogenesis. Whereas it still remains unclear whether Dnt contributes to whooping cough, its contribution to atrophic rhinitis is clear (Khelef et al., 1994; Magyar et al., 2000). CNF1 and Dnt share 30 % homology in the catalytic domain and a consensus sequence, which harbors the catalytic active cysteine. Remarkably, although CNF1 and Dnt are both deamidases and transglutaminases that target the same glutamine residue in the switch II region of Rho GTPases, CNF1 preferentially acts as a deamidase, whereas Dnt primarily is a transglutaminase in presence of polyamine (Schmidt et al., 1999). It has already been shown that Rac1, RhoA and Cdc42 can be deamidated and transglutaminated by Dnt (Horiguchi et al., 1997; Masuda et al., 2000).
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Uropathogenic Escherichia coli cause resistance to apoptotic cell death of infected cells by epigenetically suppressing BIM expression

Uropathogenic Escherichia coli cause resistance to apoptotic cell death of infected cells by epigenetically suppressing BIM expression

In our study, it has been shown that UPEC dramatically deacetylate histone 3 and histone 4 in Sertoli cells (Figure 21), and in the uroepithelial cell line 5637 (Fig[r]

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OPUS Würzburg | Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildstämmen

OPUS Würzburg | Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildstämmen

Diese physiologischen Stadien, in der sich eine Kultur befinden kann und der damit ver- bundenen regulatorischen Einfluss von BarA/UvrY bzw. CsrA/CsrBC spielt sicherlich eine Rolle bei der Menge des produzierten Zytotoxins. Dadurch lässt sich jedoch nicht erklären, warum die natürliche uvrY-Mutante E. coli 536 offenbar überhaupt kein Peptid-Polyketid syn- thetisiert und erst nach Komplementation mit dem Gen wieder dazu in der Lage ist. Da der Organismus auch ohne UvrY lebensfähig ist, ist das System nicht essentiell und die zellu- lären Vorgänge bleiben offenbar unbeeinflusst. Möglicherweise kompensieren andere Me- chanismen den Ausfall von UvrY. Da somit jedoch offenbar sowohl alle benötigten Enzy- me aktiv sind und alle Metabolite zur Verfügung stehen, wäre bei einem indirekten Einfluss auch die Synthese des Peptid-Polyketids möglich. Daher besteht auch die Möglichkeit, dass CsrA direkt eines oder mehrere Gene des PKS/NRPS-Genclusters beeinflusst und diese post- transkriptional reguliert. Eine uvrY-Mutante zeigt keine Transkription von csrB mehr ( Suzuki et al. , 2002 ). Weil CsrC eine schwächere Bindung an CsrA zeigt ( Weilbacher et al. , 2003 ), steigt vermutlich die Konzentration an CsrA in der Zelle an und bleibt an den Ziel-mRNAs ge- bunden. Diese werden dadurch degradiert oder können nicht translatiert werden. Ein solcher Einfluss von CsrA auf die Gene des PKS/NRPS-Genclusters würde erklären, warum deren Transkription in einer uvrY-Mutante nicht beeinträchtigt ist (Daten nicht präsentiert). Eine in silico Suche nach der von Dubey et al. ( 2005 ) identifizierten Konsensus-Sequenz für die CsrA- Bindung an mRNAs könnte Aufschluss darüber geben, ob post-translationale Regulation des PKS/NRPS-Genclusters stattfindet.
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Der Einfluss des Mutatorgens dnaQ auf die Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone bei Escherichia coli

Der Einfluss des Mutatorgens dnaQ auf die Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone bei Escherichia coli

432 bp großem Gen marR, ist eine Bindung des Genpodukts des mutierten marR an marO nicht mehr möglich, da ein stark verkürztes und räumlich anders orientiertes Protein zwangsläufig resultiert. Dadurch wird marRAB konstitutiv exprimiert [177]. Das durch die Derepression vermehrt gebildete MarA bindet an die regulatorischen mar-Boxen (20 bp große, konservierte DNA-Sequenzbereiche) stromaufwärts vieler Gene [202]. Von MarA beeinflusste Gene werden unter dem Begriff Mar-Regulon zusammengefasst. Nachgewiesen und charakterisiert ist ein Einfluss von MarA auf die Expression von mindestens 28 Genen [203], doch zeigen Transkriptomanalysen, dass weit über 100 Gene beeinflusst werden könnten [204, 205]. MarA erhöht direkt den Efflux bei E. coli durch Bindung an die mar-Box stromaufwärts von acrAB und tolC und der dadurch erhöhten Expression der wichtigen Effluxpumpe AcrAB-TolC [206]. Ebenso wird die Expression von micF erhöht. Diese antisense RNA reduziert die Expression von ompF. Das davon codierte Protein OmpF ist ein Porin, durch das viele Substanzen in die Bakterienzelle gelangen [207]. Somit verursacht die Deletion in marR in E. coli MII sowohl einen verminderten Influx über OmpF als auch einen erhöhten Efflux durch vermehrte Bildung von AcrAB-TolC. Die vorliegende marR-Deletion ist mit einem Anstieg des MHK-Werts für Ciprofloxacin um zwei Stufen assoziiert [155].
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Untersuchung auf das Vorkommen intrazellulärer Escherichia coli im Endometrium der Stute

Untersuchung auf das Vorkommen intrazellulärer Escherichia coli im Endometrium der Stute

Eine solche Charakterisierung dieser Virulenzfaktoren wurde von Chen et al. (2003) als Vergleich zwischen E. coli-Isolaten aus klinischen Fällen von Pyometra und Isolaten aus dem Stuhl gesunder Hündinnen durchgeführt. Sie stellten fest, dass die Virulenzfaktoren uropathogener E.coli- Stämme, wie sie bei Urogenitaltraktinfektionen beim Mensch und beim Hund nachgewiesen wurden, signifikant häufiger in Isolaten aus Pyometritiden als in Isolaten aus dem Stuhl gesunder Hündinnen vorkommen. Auffallend war vor allem, dass die meisten Stämme aus Pyometraisolaten meist 3 oder mehr der Genstrukturen, die für Virulenzfaktoren uropathogener E. coli-Stämme codieren, aufwiesen. Insgesamt konnte eine weitgehende Übereinstimmung zwischen E. coli- Stämmen, die mit Pyometra assoziiert wurden, und uropathogenen Stämmen gefunden werden, teilweise waren sogar dieselben Stämme beteiligt. Die bei der Hündin als besonders relevant erscheinenden Virulenzfaktoren waren die Adhäsine P-, Typ I- und S-Fimbrien. Weitere, die Virulenz und Pathogenität der Stämme verstärkenden Faktoren, waren α-Hämolysin und der cytotoxische Nekrosefaktor 1 (CNF). All diese Faktoren werden auch in einer mikrobiologischen Studie von Emody et al.
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Untersuchungen über den Einfluß Enterohämorrhagischer Escherichia coli auf humane Endothelzellen

Untersuchungen über den Einfluß Enterohämorrhagischer Escherichia coli auf humane Endothelzellen

Das bakteriophagencodierten SLT ist ein A/B-Toxin. Das Verhältnis zwischen A- und B- Untereinheit beträgt 1:5, die Masse der A-Einheit 32kDa, die der B-Untereinheit 7kDa (18), somit liegen beide Molekülmassen über dem cut-off. Andere von den EHEC gebildete Toxine, wie das enteroaggregative heat-stable Toxin-1 (89% der EHEC können das 4,1kDa große EAST-1 bilden (23)) und das EHEC-Enterohämolysin scheiden als Agentien der Endothelzellstimulation ebenfalls durch ihre Molekülgröße aus (15, 22). Das von den verschiedenen EHEC gebildete porenformende Enterohämolysin ist 107kDa groß und sein Vorkommen ist eng mit den Serotypen O157, O111 und O26 assoziiert (52). Die Inzidenz des EHEC-Hämolysin, welches mit dem alpha-Hämolysin verwandt, aber nicht mit diesem identisch ist, ist in SLT-produzierenden E. coli hoch. SLT und EHEC-Hämolysin haben bei der Störung wichtiger Zellfunktionen einen synergistischen Effekt (15).
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Bedeutung der Siderophorsysteme für die Pathogenität der extraintestinal pathogenen Escherichia coli

Bedeutung der Siderophorsysteme für die Pathogenität der extraintestinal pathogenen Escherichia coli

Der Pädiater und bedeutende Bakteriologe Theodor Escherich präsentierte im Jahr 1885 seine Forschungsarbeit über die Morphologie und Eigenschaften einer Population von Darmbakterien aus Neugeborenen und Säuglingen, die er als „Bacterium coli commune“ bezeichnete (1). Im Jahr 1919 wurde die Spezies ihm zu Ehren in Escherichia coli (E. coli) umbenannt. Die Bakterienspezies E. coli aus der Familie der Enterobacteriaceae stellt in vielerlei Hinsicht eines der bedeutendsten Bakterien für die Naturwissenschaft überhaupt dar. Neben seiner herausragenden Funktion als Modellorganismus für die naturwissenschaftliche Forschung werden die zahlreichen Facetten dieses faszinierenden Bakteriums durch seine medizinische Bedeutung in besonderem Maße hervorgehoben (2). Als gramnegatives, sporenloses, fakultativ anaerobes Stäbchenbakterium kolonisieren E. coli als Kommensale den menschlichen Gastrointestinaltrakt bereits wenige Stunden nach Geburt (3-5). Die bevorzugte intestinale Nische entspricht der oberen muzinösen Schicht von Colon und Zökum, wo es sich aufgrund seiner vermeintlich überlegenen Fähigkeit zur Utilisation von Kohlenhydraten, wie zum Beispiel Glukonat, zu einer der dominierenden Spezies in diesem Habitat etabliert hat (6, 7).
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Escherichia coli α-Hämolysin: ein Entzündungsmediator bei Colitis ulcerosa

Escherichia coli α-Hämolysin: ein Entzündungsmediator bei Colitis ulcerosa

Schon seit einigen Jahrzehnten wird die Rolle von HlyA als Virulenzfaktor bei Diarrhöerkrankungen diskutiert [74]. Ein möglicher Pathomechanismus konnte jedoch bislang nicht gefunden werden. In einer Arbeit aus unserer Gruppe konnte im Zellmodell die Bildung von Focal Leaks am Kolonepithelzellen durch HlyA nachgewiesen werden und erstmals auch als neuartiger Mechanismus für die bakterielle Translokation aufgezeigt werden [20]. Die durch UPEC-HlyA induzierten Läsionen unterscheiden sich jedoch von den Läsionen, welche die als enteropathogen definierten E. coli-Stämme an der Darmschleimhaut bilden (attaching and effacing (E/A) lesions). Dieser Unterschied ist genetisch determiniert. Dem in dieser Arbeit verwendeten E. coli 536 fehlt das auf der LEE (Locus of enterocyte effacement)-Pathogenitätsinsel kodierte E. coli attaching and effacing- Gen (eae-Gen), welches alle enteropathogenen E. coli tragen. Die durch enteropathogene E. coli induzierten Intimin- und EspF-vermittelten Läsionen mit füßchenförmiger Aktin-Formation lassen sich nach Infektion mit E. coli 536 nicht nachweisen [75]. Also scheint der Pathomechanismus der Focal Leaks am Kolonepithel sich von den durch enteropathogene E. coli induzierten Läsionen grundsätzlich zu unterscheiden.
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Production of glutaconic acid in recombinant Escherichia coli

Production of glutaconic acid in recombinant Escherichia coli

Six genes encoding enzymes that together catalyze the conversion of 2-oxoglutarate to glutaconate were constructed on two plasmids and transformed into E. coli. All genes were expressed and yielded active enzymes. The data indicate that the recombinant E. coli BL21 (DE3) strain indeed produced glutaconate, although at the initial low level of 0.1 mM. The three-fold enhancement of glutaconate production, from 0.1 to 0.3 mM, by the addition of 10 mM glutamate suggested that this amino acid rather than glucose served as carbon source. The cells were grown on Standard I medium, which contained 5 mM glucose and 3 mM glutamate, derived from yeast extract and peptone. Further addition of 10 mM glutamate, 0.2 mM riboflavin and 2 mM ferric citrate raised the yield of glutaconate from 0.3 mM to 2.7 ± 0.2 mM (table 3), as well as the activity of the 2-hydroxyglutarate dehydratase from C. symbiosum by a factor of six. The iron requirement stems from the two [4Fe-4S] clusters in this enzyme. The slight improvement with riboflavin is probably due to 0.2 riboflavin and 1.0 riboflavin-5'-phosphate (FMN) as prosthetic groups of the dehydratase (Hans et al., 1999). A further rise in glutaconate production could be achieved by improving the expression of the genes encoding glutaconate CoA-transferase. The data also indicate that the concentration of glutaconate inside the cells (16 mM) is about 6 times higher than that in the medium (2.7 mM). Therefore, the export of glutaconate, probably mediated by the succinate transporter (Janausch et al., 2001), appears to limit its production. The export could be easier with more flexible glutarate, whose production requires glutaconyl-CoA reductase. Most likely this enzyme is involved in the synthesis of cyclohexane carboxylate and benzoate by S. aciditrophicus. when axenically grown on crotonate.
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Nachweis und Charakterisierung von Shigatoxin-bildenden Escherichia coli in Wildwiederkäuern

Nachweis und Charakterisierung von Shigatoxin-bildenden Escherichia coli in Wildwiederkäuern

Um EHEC-Ausbrüche einzudämmen oder gar zu vermeiden, ist eine enge Zusam- menarbeit von Gesundheitsamt, Lebensmittelbehörde und Veterinäramt erforder- lich. Liegt ein EHEC-Verdacht oder eine Erkrankung vor, so ist das Gesundheitsamt schnellstens zu informieren und durch Identifizierung und Eliminierung des Infektionsagens eine EHEC-Ausbreitung zu verhindern (RKI, 2008). Dies ist nur sicherzustellen, wenn auch entsprechend qualifizierte und akkreditierte Labore die Untersuchungen durchführen. Daher wurden auf der Grundlage von Artikel 33 der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 Nationale Referenzlaboratorien (NRL) für lebensmittelbedingte Zoonosen eingerichtet. Die Aufgaben des NRL-E. coli in Berlin bestehen in der Identifizierung der Infektionsquelle, Aufklärung des Infektionswe- ges und der näheren Charakterisierung der E. coli-Pathovare (E LLERBROEK et al., 2009).
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Charaktiersierung des Formiat-Kanal-Proteins FocA aus Escherichia coli

Charaktiersierung des Formiat-Kanal-Proteins FocA aus Escherichia coli

Obwohl drei Kristallstrukturen veröffentlicht und erste Mechanismen der Translokation postuliert wurden, ist bis heute unklar, wie der Export und Import von Formiat über FocA reguliert wird. Eine Möglichkeit stellt die pH-abhängige Änderung der Konformation von FocA dar, wie sie schon von Lü et al. (2011) beobachtet werden konnte. Eine weitere Möglichkeit wäre die Regulation über einen Interaktionspartner. Protein-Protein Interaktionen sind in fast allen zellulären Prozessen involviert und regulieren eine Vielzahl von Stoffwechselwegen (Gascoigne & Zal, 2004; Pawson & Nash, 2000; Warren, 2002). Aufgrund der Tatsache, dass das Gen, welches für FocA codiert mit dem Gen pflB in einem Operon liegt und die Transkription beider Gene koordiniert reguliert wird, wurde vermutet, dass FocA mit PflB interagieren könnte. Es konnte schon für den Ammoniumtransporter AmtB in E. coli gezeigt werden, dass dieser Transporter durch ein cytosolisches Protein (GlnK) reguliert wird, dessen Gen in einem Operon mit amtB lokalisiert ist (Coutts et al., 2002). Zudem ist PflB das Enzym, welches die größte Menge an Formiat in E. coli produziert. PflB hat eine berechnete Molekularmasse von 85 kDa und liegt im Cytoplasma als 170 kDa Homodimer vor (Becker & Kabsch, 2002; Becker et al., 1999). Die Kristallstruktur eines PflB – Homodimers ist in Abb. 5 gezeigt.
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Untersuchungen zur Shigatoxin-Bildung bei Escherichia coli-Stämmen von Hausschweinen

Untersuchungen zur Shigatoxin-Bildung bei Escherichia coli-Stämmen von Hausschweinen

Die Induktion des Bakteriophagen wird in erster Linie durch DNS-schädigende Substanzen ausgelöst, z. B. durch MMC (Łoś et al. 2010). MMC reagiert mit den DNS-Molekülen der Bakterienzelle und schädigt diese, indem es durch bifunktionelle Alkylierung kovalente Bin- dungen in und zwischen den DNS-Einzelsträngen provoziert (Verweij und Pinedo 1990). Die DNS-Schäden lösen in der betroffenen Bakterienzelle den SOS-Reparaturmechanismus aus, der mit der Aktivierung der zellulären Protease RecA startet. Eine ähnliche Wirkung wie MMC haben Chinolon-Antibiotika. Diese Wirkstoffe hemmen die bakterielle Gyrase und lösen die SOS-Antwort über die Akkumulation von einzelsträngiger DNS aus (Matsushiro et al. 1999, Zhang et al. 2000). Das aktivierte RecA spaltet nicht nur sein Substrat LexA, welches als Repressor der SOS-Gene fungiert, sondern stimuliert auch die Autoproteolyse des Phagen-Repressors CI, der im Stadium der Lysogenie die Transkription aller anderen Phagengene unterdrückt (Rozanov et al. 1998, Koudelka et al. 2004). Die Proteolyse des Repressors CI erfolgt an den Aminosäuremotiven Ala-Gly und Cys-Gly, beim Phagen 933W jedoch an dem Motiv Leu-Gly (Koudelka et al. 2004). Die RecA-abhängige Phageninduktion kurbelt bei entsprechenden Prophagen auch die Stx-Produktion an. So bilden recA-defiziente Mutanten der EHEC-Stämme EDL 933 und 86-24 signifikant weniger Stx2a bzw. Stx2 als ihre Elternstämme mit intaktem recA-Gen. Zusätzlich verbleibt Stx in diesen Mutanten über- wiegend in der Bakterienzelle und kann, anders als bei den Ursprungsstämmen, nicht mehr im Kulturüberstand nachgewiesen werden (Mühldorfer et al. 1996, Fuchs et al. 1999). Erst die Komplementierung mit recA rekonstituiert wieder die höhere Stx2a- bzw. Stx2-Produktion und -Freisetzung. Intakte, Stx2-konvertierende Phagenpartikel werden ebenfalls nur in den recA-positiven bzw. -komplementierten Stämmen E. coli 86-24 bzw. E. coli C600( φ86-24) gebildet (Fuchs et al. 1999). Möglicherweise spielen auch Polyamine eine Rolle bei der RecA-vermittelten SOS-Antwort. Denn die SOS-Antwort, ausgelöst durch MMC, UV- oder γ- Strahlen, ist in Stämmen, die unfähig sind, Polyamine zu synthetisieren, schwächer als wenn diese Stämme mit Polyaminen, z. B. Putrescin oder Spermidin, supplementiert werden (Kim und Oh 2000).
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Expression und Reinigung des Apolipoproteins E3 in Escherichia coli und Insektenzellen

Expression und Reinigung des Apolipoproteins E3 in Escherichia coli und Insektenzellen

Für biochemische Untersuchungen ob hsApoE3 sich als Medikamentenfähre eignet, ist es erforderlich, dass das Protein in größeren Mengen produziert werden kann und in seiner aktiven Form vorliegt. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren einer Methode zur Expression und Aufreinigung des hsApoE3. Bisher war es nicht gelungen, die erstellte cDNA Sequenz des ApoE3 mit dem pET 24d Vektor in E. coli BL21(DE3) zu exprimieren. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit weitere pET Vektoren, die jeweils für einen bestimmten TAG kodieren, zur Expression und Produktion des hsApoE3 getestet. Zusätzlich wurde das Bac-to-Bac Baculovirus Expressionssystem erprobt.
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Untersuchungen zum Alternativen Terpenbiosyntheseweg in Escherichia coli und Nicotiana benthamiana

Untersuchungen zum Alternativen Terpenbiosyntheseweg in Escherichia coli und Nicotiana benthamiana

empfindlichen Radio-Detektion, 13 C-markierte Metabolite für NMR- und GC-MS-Analysen. Verschiedene chemische Methoden sind zur Synthese unmarkierter Intermediate des DXP- Weges beschrieben worden. Die Darstellung isotopenmarkierter Verbindungen gestaltete sich schwieriger, da zur chemischen Synthese mehrfach markierter Intermediate bestimmte Strategien, zahlreiche Reaktionsschritte und die Isolierung einzelner Zwischenprodukte über ein oder mehrere Reinigungsschritte erforderlich sind (Hecht et al., 2001b). Mit enzymati- schen Synthesen kann im Vergleich zur chemischen Darstellung in kurzer Reaktionszeit eine hohe Ausbeute erzielt werden. Die Reaktionsprodukte weisen zudem eine hohe Stereoselek- tivität auf. Synthesen laufen im wässrigen Milieu und häufig als Ein-Topf-Reaktion ab. Zur Synthese von radioaktiv- und schwerisotopenmarkiertem Pyruvat wurde der rekombinan- te E. coli-Stamm YYC202 verwendet (Gerharz et al., 2001). Aufgrund mehrerer Mutationen im Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex scheidet der Stamm nach Glucosezugabe Pyruvat aus. Mehrstufige chemische oder enzymkatalysierte Umsetzungen lassen sich durch Einsatz des
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Untersuchung der putativen Substratbindungsstelle von Escherichia coli Parvulin 10

Untersuchung der putativen Substratbindungsstelle von Escherichia coli Parvulin 10

2 Bildung und der Stabilisierung der dreidimensionalen Proteinstruktur einschließlich der Substrat- bindungstasche. Außerdem sind sie entscheidend für die Abgrenzung des Enzyms gegenüber dem umgebenden Milieu sowie für die An- oder Abwesenheit von Ionen und Wasser im Reaktions- zentrum. In einer Vergleichsstudie zur Proteingrößenverteilung, in der aus vollständigen geno- mischen Sequenzen Proteinlängen abgeleitet wurden, kamen T IESSEN et al. 2012 [6] nach Auswertung zweier Datensätze mit insgesamt 7,3 Millionen Proteinsequenzen von 1442 Spezies zu dem Ergebnis, dass die durchschnittliche Proteinlänge in Archaeen 283 AS, in Bakterien 319 AS und in Eukaryoten 472 AS beträgt. Laut dieser Studie benötigen Enzyme demnach  200 AS zur Stabilisierung ihrer Raumstruktur, wohingegen die katalytischen Zentren durchschnittlich aus lediglich 3-5 Aminosäure- resten bestehen. Genannt sei die Cysteinprotease Papain aus Carica papaya (UniProtKB: P00784 [134-345]), von deren 211 AS nur Cys 25 und His 159 direkt an der Katalysereaktion beteiligt sind (Asn 175 [vermutlich Stabilisierung der His 159 -Imidazolform] und Gln 19 [Ausbildung des Oxyanion-Lochs] wird nur eine indirekte Beteiligung am Katalysemechanismus zugeschrieben) [7, 8]. Zur Stabilisierung ihrer Struktur bilden vor allem kleinere Enzyme häufig aus Di-, Tetra- oder Dekameren zusammengesetzte Quartärstrukturen [9]. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Parvulin 10 (Par10) aus Escherichia
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Untersuchung der für einen Tat-Transport in Escherichia coli erforderlichen Substrateigenschaften

Untersuchung der für einen Tat-Transport in Escherichia coli erforderlichen Substrateigenschaften

Nach der Faltung erfolgt zunächst eine Interaktion des Signalpeptides mit der Cytoplasma- membran, die nicht RR-spezifisch ist und an der keine Tat-Komponenten beteiligt sind (Berghöfer & Klösgen, 1999; Cline & Mori, 2001; Brüser et al., 2003; Hou et al., 2006; Shanmugham et al., 2006). Durch die Interaktion mit den Phospholipiden nimmt die h-Region des Signalpeptides anscheinend eine Sekundärstruktur (α-Helix) ein (San Miguel et al., 2003), die eventuell erst die RR-spezifische Erkennung des Signalpeptides ermöglicht. Diese erfolgt durch einen TatBC-Komplex, der wahrscheinlich dem in dieser Arbeit nachgewiesenen 580 kDa- Komplex entspricht (vgl. 4.6). Die erste Interaktion findet dabei zwischen dem N-Terminus von TatC und dem Signalpeptid (in der Nähe des konservierten RR-Motivs) statt (Alami et al., 2003; Gérard & Cline, 2007; Holzapfel et al., 2007; Kreutzenbeck et al., 2007) und bleibt während der gesamten Translokation bestehen (Gérard & Cline, 2006). An den gebildeten Substrat-TatBC- Komplex erfolgt in Thylakoiden PMF-abhängig die Assemblierung von TatA-Oligomeren (Cline & Mori, 2001; Mori & Cline, 2002; Dabney-Smith et al., 2006), so dass das aktive Translokon gebildet wird. An E. coli-INV wurde gezeigt, dass die Δψ-abhängige Energetisierung des Translokons auch ohne Vorhandensein des precursors möglich ist (Bageshwar & Musser 2007). Somit ist es vorstellbar, dass die Assemblierung des E. coli Tat-Translokons, bzw. von TatA- Oligomeren, auch ohne einen TatBC-Substrat-Komplex erfolgen kann, und dieser erst zu einem späteren Zeitpunkt bindet.
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Experimentelle Infektion von Kälbern mit Escherichia coli 0104:H4

Experimentelle Infektion von Kälbern mit Escherichia coli 0104:H4

Die Ausscheidungsraten der inokulierten E. coli variierten stark zwischen den einzelnen experimentell infizierten Tieren. Dabei traten diese Unterschiede sowohl bei Rindern wie auch bei Schafen unabhängig von Rasse, Alter, Inokulationsdosis, Inokulationsstamm oder Fütterung auf. Als mögliche Gründe werden Unterschiede der tierspezifischen Immunität, der physiologischen und biochemischen Konditionen im GIT, der kompetitiven Mikroflora und der genauen Lokalisierung der Infektion angeführt [102]. Auch zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen Kälbern und adulten Tieren bezüglich der Höhe und Dauer der STEC- Ausscheidung. Kälber scheiden unabhängig von der Kotmenge STEC in höheren Zahlen und über einen längeren Zeitraum aus [66]. Dabei scheint vor allem der Entwicklungsgrad der Vormägen von Bedeutung zu sein [66, 102]. Auch eine hohe Zellproliferationsrate im GIT scheint einen vermindernden Effekt auf die Ausscheidung von STEC zu haben [177]. In den meisten Studien nahm die Zahl der ausgeschiedenen STEC nach einer initial sehr hohen Ausscheidung über eine Zeitdauer von 2 - 3 Wochen deutlich ab. Neben Tieren, die den inokulierten Stamm nur über kurze Zeit oder in geringen Mengen ausschieden, konnten mehrfach sogenannte „supershedder“ beobachtet werden, die STEC meist intermittierend über einen sehr langen Zeitraum ausschieden [43, 45, 49, 66, 140, 156, 214, 223].
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Das Kupfer-transportierende CusCFBA-Efflux-System aus Escherichia coli

Das Kupfer-transportierende CusCFBA-Efflux-System aus Escherichia coli

Das zentrale Transportprotein des CusCBA-Efflux-Komplexes ist ein Protein der RND- Familie (Saier et al., 1994; Tseng et al., 1999; Saier, 2000). In veröffentlichten bakteriellen Genomsequenzen lassen sich über 100 Vertreter dieser Proteinfamilie identifizieren, doch ist nur ein Teil von ihnen bisher charakterisiert. Von vier Vertretern konnte mit Hilfe von Reportergenfusionen eine Aufklärung der Membrantopologie erfolgen. Dabei handelt es sich bei AcrB (E. coli) (Fujihira et al., 2002), MexB und MexD (P. aeruginosa) (Gotoh et al., 1999; Guan et al., 1999) um drei Transporter organischer Verbindungen, die Resistenz gegen Antibiotika vermitteln, und bei CzcA (R. metallidurans CH34) (Goldberg et al., 1999; Pribyl, 2001) um einen Schwermetalltransporter. RND-Proteine besitzen zwölf Transmembran Durchgänge (TMH) sowie zwei große hydrophile, periplasmatisch lokalisierte Domänen zwischen den TMH I und II sowie zwischen TMH VII und VIII. C- und N-Terminus befinden sich im Cytoplasma. Auf Grund der Homologie von CusA zu diesen vier Proteinen und auf der Grundlage der Vorhersage membrandurchspannender Sequenzen über des Internetprogramm SOSUI ( http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html ) konnte für CusA ein zweidimemsionales Topologiemodell erstellt werden (Abb. 7).
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