A Zn* pontmutáció szerepének vizsgálata a DNS-hiba tolerancia

törzs érzékenységét különböző DNS-károsító ágensek hatására. Nagy dózisú UV sugárzásnak kitett, valamint MMS-t tartalmazó lemezen (az N2 és N3-hoz hasonlóan) a vad típushoz képest érzékenyebb fenotípust mutat a Zn* pontmutáns Rad18 fehérjét kifejező törzs, míg HU és bleomycin hatására nincs különbség a vad és a pontmutáns Rad18 fehérjét tartalmazó törzs érzékenysége között. Úgy tűnik, hogy a két aminosav cseréjével ismét a Rad18 egy fontos funkcióját érintettük, melynek következtében nem tud megfelelően működni a DNS-hiba tolerancia folyamataiban.

Ki kellett zárnunk azt az eshetőséget, hogy a mutáns fehérjék expressziós szintjében bekövetkezett változás okozza az érzékeny fenotípusokat. Ismét HA jelölő fehérjét kódoló gént klónoztunk a vad és mutáns Rad18-at hordozó expressziós vektorokba, ahogy azt az N2 és N3 esetében is tettük. Amint azt a 33. ábrán láthatjuk nincsen különbség a fehérjék szintjében, tehát a tapasztalt érzékenység valamilyen részleges funkcióvesztésre utal az útvonal működésében.

33. ábra: Western blot kísérlet a deléciós fehérjék expressziós szintjének vizsgálatára. A mutáns fehérjéket 10 %-os akrilamid gélen választottuk el. Az anti-HA elsődeleges ellenanyagot 5000-szeres hígításban, míg az anti-PGK ellenanyagot 10.000 x-es hígításban alkalmaztuk.

Annak érdekében, hogy kideríthessük, a lecserélt aminosavak hol kapcsolódnak be a Rad18 funkciójának kialakításába, episztázis analízist végeztünk el az N2 és N3 deléciós mutáns Rad18 esetében ismertetett logikát követve.

A Zn* mutánsban előállítottuk a DDT útvonal három különböző ágát inaktiváló gének (RAD30, REV1, MMS2) delécióját és megvizsgáltuk a kettős mutáns törzsek UV sugárzásra és MMS kezelésre mutatott érzékenységét. Elsőként megvizsgáltuk, hogy az általunk létrehozott Zn* pontmutáns a RAD30-cal egy episztázis csoportba sorolható e. A 34./A. képen láthatjuk, hogy a Δrad30Δrad18 + Zn* törzs érzékenyebb UV és MMS kezelés hatására, mint az Δrad18 + Zn* vagy a Δrad30 törzs egyedül. Ez arra enged következtetni, hogy a két aminosav, amit

55

lecseréltünk, nem a Rad30 útvonal működéséhez járul hozzá. A 34. ábra azt mutatja, hogy az általunk előállított Zn* mutáns a REV1 útvonalat sem károsította, hiszen a kettős mutáns sokkal jobban érzékenyítette az élesztő törzset UV és MMS kezelés hatására is, mint az egyes mutánsok önállóan.

A következő lépésben az MMS2 gént távolítottuk el, hogy a RAD5 út inaktiválását érjük el. Ahogyan azt a 34./C. ábrán láthatjuk, a Zn* és MMS2 deléciót egyszerre hordozó mutáns azonos érzékenységet mutat az ∆mms2 törzzsel. Tehát kijelenthetjük, hogy az episztázis analízis logikája alapján ugyanazon hibajavítási útvonalba sorolhatók. Ez számunkra azt jelenti, hogy a két lecserélt aminosav által a DNS-hiba tolerancia útvonal hibamentes ágának működését rontottuk el.

34. ábra: Episztázis analízis a Zn* és a DDT három alútvonalának képviselőjével. RAD30 (A.), REV1 (B.), MMS2 (C.) és a Zn* kapcsolata. Δrad18+WT: vad típusú RAD18-at plazmidról kifejező törzs.

Δrad18+Zn*: Zn* deléciós RAD18-at plazmidról kifejező törzs. Δrad18Δrad30+WT: RAD18 és RAD30 gének genomi delécióját tartalmazó és a vad típusú RAD18-at plazmidról termelő törzs

Δrad18Δrad30+Zn*: RAD18 és RAD30 gének genomi delécióját tartalmazó és a Zn* deléciós RAD18- at plazmidról termelő törzs. Δrad18Δrev1+WT: RAD18 és REV1 gének genomi delécióját tartalmazó és a vad típusú RAD18-at plazmidról termelő törzs Δrad18Δrev1+Zn*: RAD18 és REV1 gének genomi delécióját tartalmazó és a Zn* deléciós RAD18-at plazmidról expresszáló törzs. Δrad18Δmms2+WT:

RAD18 és MMS2 gének genomi delécióját tartalmazó és a vad típusú RAD18-at plazmidról kifejező törzs. Δrad18Δmms2+Zn*: RAD18 és MMS2 gének genomi delécióját tartalmazó és a Zn* deléciós RAD18-at plazmidról kifejező törzs.

56 IV.4.2.1. Spontán mutagenezis vizsgálata

Mint azt az előzőekben láthattuk, a különböző genetikai vizsgálatok szerint az általunk létrehozott Zn* kettős pontmutáns Rad18 fehérje szintén a DNS-hiba tolerancia útvonal RAD5 és MMS2-UBC13 alkotta hibamentes javítást biztosító ág működésében érintett. A kapott eredmény megerősítésére ellenőriztük a Rad6/Rad18 útvonal mutagén ágának működését az előállított Zn* kettős pontmutáns Rad18 fehérjét hordozó törzsekben, oly módon, hogy meghatároztuk a deléciós törzs spontán mutációs rátáját. A Rad18 pontmutációs konstruktot hordozó törzsben megemelkedett a spontán mutációk száma a vad típusú RAD18 gént tartalmazó kontrollhoz képest a teljes MMS2 gén delécióját hordozó törzzsel összevethető módon (35. ábra), hiszen a mutagén ág túlműködik az inaktív hibamentes reparációs alútvonal miatt. Ez az episztázis analízis kísérleteivel összhangban további bizonyíték arra, hogy a lecserélt aminosavak nélkülözhetetlenek a hibamentes DNS-hiba tolerancia alútvonal működéséhez.

35. ábra: Spontán mutagenezis. Δrad18+WT: vad típusú RAD18-at plazmidról kifejező törzs.

Δrad18+Zn*: Zn* deléciós RAD18-at plazmidról kifejező törzs. Δrad18Δmms2+WT: RAD18 és MMS2 gének genomi delécióját tartalmazó és a vad típusú RAD18-at plazmidról kifejező törzs. Az oszlopok három kísérlet átlagait és az ebből számolt szórás valamint szignifikancia értékeket mutatják. Ha a p- érték <0.05 akkor az eredmény szignifikánsnak tekinthető, ha a p-érték> 0.05, akkor nem szignifikáns (n.s.).

57

IV.4.2.2. A Zn* Rad18 fehérje által kialakított fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálata élesztő kettős hibrid módszerrel

Megvizsgáltuk, hogy a genetikailag jól jellemzett Zn* Rad18 pontmutáns kölcsönhatásba tud-e lépni a Rad18 fehérje ismert kölcsönható partnereivel. Fenti eredményeink, és az irodalmi adatok alapján elsősorban a Rad5-tel való asszociációt kívántuk vizsgálni.

A kölcsönhatások vizsgálatánál a Rad6 és PCNA interakciót kontrollként alkalmaztuk, csakúgy, mint az N-terminális mutánsoknál tettük (28., 29. ábra). Láthatjuk a 36. ábrán, hogy sem a Rad6, sem a PCNA kötés nem sérült a Zn* pontmutáns Rad18 fehérje esetében. A vad típusú és Zn* fehérjét tartalmazó törzsek kivétel nélkül felnőnek a hármas szelekciós lemezen, ha a PCNA, illetve Rad6 molekulát is tartalmazza a kéthibrid rendszer. A következő lépésben azt vizsgáltuk meg, hogy a Zn* mutáns fehérje képes e homodimert alkotni. Azt tapasztaltuk, hogy ebben a képességben sem károsodott a Rad18 fehérje az aminosavcserék által (36. ábra A. kép).

Azonban, amint az a 36. ábrán látható, a Zn* Rad18 mutáns nem tudott kölcsönhatni a Rad5 fehérjével. Míg a kontroll lemezen (–L/-T) a törzsek kivétel nélkül felnőnek, addig a –L/- T/-H lemezen csak azok képesek, ahol interakció van a két fehérje között, esetünkben csak a vad típusú Rad18 és Rad5 fehérje között detektálható kölcsönhatás (36. ábra A kép). Élesztő kettős hibrid kísérletekkel így meghatároztuk, hogy a 190-es és 193-as ciszteinek, illetve a cink- ujj motívum nélkülözhetetlenek a Rad18-Rad5 heterodimer kialakulásához.

36. ábra: Élesztő kettős hibrid kísérlet az Zn* mutáns által kialakított kölcsönhatások vizsgálatára.

Rad18-Rad6 interakció, dimerképzés, Rad18-Rad5 interakció (A.) Rad18-PCNA interakció (B.), vizsgálata. (AD: activation domain, BD: binding domain, -: üres vektorok) Kontroll –L-T (leucin és triptofán aminosavak nélküli) lemezen mindegyik törzs felnő, míg a –L-T-H (leucin, triptofán és hisztidin aminosavak nélküli) táptalajon csak a kölcsönhatást mutató telepek tudnak felnőni.

58