Írásos segédanyag található a:

BIOLÓGIA és BIOTECHNOLÓGIA 4. rész

BIOLÓGIA és BIOTECHNOLÓGIA 4. rész

Előadók: Ballagi András,

c. egyetemi tanár

Richter Gedeon NyRt. - BME

Írásos segédanyag található a:

1

Írásos segédanyag található a:

http://oktatas.ch.bme.hu

/oktatas /konyvek /mezgaz

/Biol-biotech-vegyész-MSc címen

A tananyag szerkezete:

2

Overwiew

Biorector

Main

Imp

Features

Kevert tankreaktor

– Stirred Tank Reactor (STR) Air Lift Reactor

STR geometriai paraméterei

STR geometriai paraméterei

STR keverő típusok

STR keverő típusok

Rushton turbine

Rushton turbine

A tananyag szerkezete:

12

A mikroba szaporodás alapösszefüggései

BINÁRISAN OSZTÓDÓ MIKROORGANIZMUS

1=X₀*2⁰

2=X₀*2¹

4=X₀*2²

n=1

n=2

8=X₀*2³

16=X₀*2⁴

n=3

n=4

n:a generációk száma

. .

X=X₀2ⁿ

A mikroba szaporodás alapösszefüggései

t

g

n = t

a generációk száma

Generációs idő - doubling time generation time

N, x

Sejtszám db/ml

Sejttömeg: sz.a.

mg/ml, g/l,kg/m³

t

n 0

t t

0

2 x 2

x

x =

^g

=

MONOD, 1942

dt x

dx = µ .

µ: fajlagos növekedési sebesség

A mikroba szaporodás alapösszefüggései

x dt .

dx = µ N

dt

dN = ν .

e t

x

x = ^µ N = N e ^{ν t}

Jacques Monod

v : fajlagos szaporodási sebesség

t 0 e x

x = ^µ N = N ₀ e ^{ν t}

µ és a generációs idő kapcsolata:

= ln µ 2

t

_g

A mikroba szaporodás alapösszefüggései

x ∞

t 0 e x

x = ^µ

t

x

₀

Mikróba

A mikroba szaporodás alapösszefüggései

MI AZ OKA A HANYATLÓ FÁZISNAK?

1. TÁPANYAG LIMITÁCIÓ

2. TOXIKUS METABOLIT TERMÉK(EK)

3. HELYHIÁNY

µ µ

_max

MONOD- modell

µ

_max

2

Κ

_S

S

_kritikus

S

S K

S

S

max +

µ

=

µ

A mikrobaszaporodás alapösszefüggései

µ µ

_max

Κ

_S^C

S

_kr^C

S

₀^C

C-forrás

~ ~

FERM.IDEJE

µ µ

_max

Κ

_S^N

S

_kr^N

S

₀^N

N-forrás

~ ~

FERM.IDEJE

MELYIK S LESZ LIMITÁLÓ SZUBSZTRÁT ???

Κ

_S

S

_kr

S

₀

Κ

_S

S

_kr^N

S

₀^N

µ

_max

µ

Κ

_S^O

S

_kr^O

S

₀^O

O

₂

~ ~

FERM.IDEJE

µ µ

_max

Κ

_S^V

S

_kr^V

S

₀^V

VITAMIN

-forrás

~ ~

FERM.IDEJE

MONOD modell-család

x x

P P x P

GAEDEN-féle termékképződési típusok

Primer acs. termék Szekunder acs. termék

Növekedéshez kötött Vegyes típus Növekedéshez nem kötött

µ_x µ_x

µ_x µ_P

µ_P µ_P

MONOD modell-család TERMÉKKÉPZŐDÉS KINETIKAI LEÍRÁSA

LUEDEKING – PIRET MODELL

β αµ

µ

β α

+

=

=

+

=

=

x P

P

dt dP x

dt x dx dt

r dP

1

µ_P

tgφ=α

III.

µ_X β

tgφ=α φ

φ β

III.

I II.

I: α>0 és β = 0 növekedéshez

kötött termékképzõdés II: α = 0 és β>0 növekedéshez nem

kötött termékképzõdés III: α>0 és β>0 vegyes típusú

fermentáció.

Tenyésztési módszerek: Sejtek szakaszos tenyésztése

Kevert tankreaktor Szubmerz

tenyésztés

Tenyésztési módszerek: Folyamatos tenyésztés

Dilution rate: 0.6 - 2.0 / day

Kevert tank reaktorban szubmerz tenyésztés

folyamatos átfolyással, sejtvisszatartással, vagy sejt és termék visszatartással.

250 L bioreactor Medium

Tank 4000 L

Harvest Retaining tank

unit

1000 liter each

P₁ P₂

S_o S,X

S,X

f f

V

D

V f =

D: higítási sebesség

Folyamatos tenyésztés

Friss tápoldat CSTR “leerjedt”

fermentlé P- szivattyú

sejttömeg:

i-edik szubsztrát:

V dx

dt V dx

dt f x

növekedés

= 

 

 − .

növekedés S

x i

i i

dt dx S Y

S dt f

V dS

i



 



− 

−

=

/ 0

,

) 1 (

ds Y dx =

Y: hozamkonstans

( )

^{D x}

S K

x S D Dx

dt x dx

S







 −

= +

−

=

−

= µ µ µ_max

0 dt =

dS és

= 0 dt

( )

^{S S} _Y^x dx dt D

dS _{= − −}

µ

0

Egy limitáló szubsztrát esetében:

µ=D

Az állandósult állapot szükséges és elégséges feltétele:

Folyamatos tenyésztés

D D S

K D S

S

+ −

=

max S max

= K S illetve

µ µ

( )

x Y S S Y S K D D

= − = −

S

−



  

 

0 0

µ

_max

( )

Y S x

S

D _{− =} µ

0

µ=D

FOLYTONOS FERMENTÁCIÓ

Tranziens viselkedés

Indulás szakaszosról, áttérés a folytonosra

Mindíg csak itt üzemelhet!

RÁTÁPLÁLÁSOS (FED-BATCH) TENYÉSZTÉS

A hanyatló fázis meghosszabbításaként értelmezhetjük a fed batch technikát, állandó, változó vagy periódikus módon friss tápanyago(ka)t adagolunk a rendszerbe, elvétel nincs,

állandóan növekvő térfogat.

alacsony állandó szintű S koncentráció (pl. élesztőfermentációban, glükóz represszió elkerülése),

magas állandó S koncentráció (pl. citromsav fermentációban)

prekurzor folyamatos adagolása (pl. penicillin gyártásban fenilecetsav, v. triptofán gyártásban indol)

FED BATCH FERMENTÁCIÓ NÖVEKEDÉSI GÖRBÉJE

Medium tank

A FERMENTÁCIÓS ELJÁRÁSOK OPTIMALIZÁLÁSA A FERMENTÁCIÓS ELJÁRÁSOK OPTIMALIZÁLÁSA Táptalaj összetevők (inokulum, fő táptalaj)

Oxigénellátás (keverés, buborékoltatás) Hőmérséklet

pH

Inokulum (oltótenyészet) mennyisége

29

Inokulum kora Tenyésztés ideje

Indukció (ha van) időpontja

Betáplálás ideje és sebessége

Fermentor felépítése

A tananyag szerkezete:

30

Az oxigén felhasználása eukarióta sejtben

31

O2 => 2H2O

O

O₂₂ alacsony alacsony oldhatóságúoldhatóságú a vízbena vízben Folyamatos Folyamatos OO₂₂ betáplálás kellbetáplálás kell dc _{= K}

La (c*-c) - qx dt

bevitel bevitel (OTR) (OTR)

fogyasztás fogyasztás

Oxigénellátás fermentlében

K_L – az eredő folyadékoldali tömegátadási tényező [cm.s-1],

δ_g

O₂

δ_l

k_g k_l

C

^{flokkulummikroba}

gomba pellet

32

tényező [cm.s-1],

a – térfogategységre jutó anyagátadási felület [cm².cm^-3= cm ^-1],

K_L a – eredő folyadékoldali (térfogati) oxigénabszorpciós együttható[h-1],

C* – telítési oxigénkoncentráció (mg/dm3), C – az aktuális oldottoxigén-koncentráció (mg/dm3).

l

egyedi sejt

A z oxigén útjának leglassabb lépése a gázfázisból a

folyadékfázisba való átmenet.

OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS

A mikrobák oxigénigényét két módon lehet megadni:

1. légzési sebesség =

dc dt

[ mmol O₂/ dm³.h], [kg O₂/ m³ .h]

Q dc

= 1

[ h^-1 ]

2. fajlagos légzési sebesség

Az oxigén is lehet limitáló szubsztrát

Q x

dc

= 1 dt

[ h^-1 ]

2. fajlagos légzési sebesség

dx dt

c

K c x

O

= µ

_max

+

2

Y x

O

= ∆ c

∆

OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS

dc dt

1 Y

dx dc

1 Y

c

K c x

O O

max

O₂

= − = −

µ +

Q 1 x

dc dt

1 Y

c

K c

O

max

O₂

= = −

µ +

Q ≅ Q

Q ≅ Q _max

µmax – fajlagos növekedési sebesség

Yo – eredő oxigénhozam (az elnevezés kissé zavaró, hiszen itt nem oxigén-előállításról van szó); jobb az oxigénre vonatkozó eredő hozam kifejezés)

Qmax – maximális fajlagos oxigénigény vagy maximális fajlagos légzési sebesség

K_O2 – oxigénre vonatkozó szubsztráttelítési állandó (Monod-modell)

OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS

Q Q_max=µ_max/Y_O

nulladrendű kinetika

Q

max

Q ≅

elsőrendű kinetika

K_O2 C_{kr C}

2

max

K

O

Q c Q ≅

Ckr – kritikus oldottoxigén koncentráció

OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS OXIGÉNIGÉNY ÉS LEVEGŐZTETÉS

A glükóz és oxigén, mint szubsztrátok összehasonlítása (Saccharomyces cerevisiae)

Glükóz Oxigén

Koncentráció a fermentlében 1% ≈104 mg/dm 7 mg/dm3

Kritikus koncentráció 50 mg/dm3 0,7 mg/dm

Kritikus koncentráció 50 mg/dm3 0,7 mg/dm

Fajlagos felhasználási 580 mg/g.h 208 mg/g.h sebesség

A tananyag szerkezete:

37

Sterilisation

Sterilisation are applied:

- to ensure that the process is carried out only with the desired organism, to avoid loss in productivity and competition for the substrates

- to avoid environmental contamination

- to prevent deterioration of the final product, e.g., beta-lactam antibiotics

38

- to prevent deterioration of the final product, e.g., beta-lactam antibiotics contaminated by beta-lactamase-producing bacteria

- to prevent contamination of the final product, e.g., pharmaceutical products by pyrogene compounds.

Sterilisation by

- removing organisms (filtration) - heating

- irradiation - chemicals

- extreme circumstances in the culture, e.g., pH, toxic substrates

mechanism of killing

heat (protein, DNA, RNA; the function of water) heat (protein, DNA, RNA; the function of water) radiation

- UV (pyrimidine dimers),

- gamma-ray, X-ray (breaking DNA and/or create peroxides and free radicals)

chemicals (oxidising or alkylating, but often also toxic, carcinogenic, explosive⁾

Kinetics of heat sterilization

Decimal

Practical methods:

batch: autoclave,

direct steam injection, indirect heating

(problems by big volumes) continuous flow sterilisation

Methods for heat sterilizations

1.) rapid heating up

2.) holding at the sterilising temperature 3.) rapid cooling

Schematic diagrams of continuous flow sterilisation

Factors

Filter sterilisation

by depth filters (fibrous material like fibreglass, cotton, mineral wool, cellulose, asbestos)

N/N_o = e^-Kx x - depth of filter

x can be calculated - necessary parameters:

- total amount of air provided, e.g., 10 m³/min for 100 hr.

44

- total amount of air provided, e.g., 10 m /min for 100 hr.

- linear air velocity, e.g., 0.15 m/sec.

- air contaminated by, e.g., 200 microorg./ m³ - desired sterility, e.g., 1 microorg./ 1000 m³

Membrane filters (absolute filters with 0.2-0.45 µm pore size) remove bacteria but not viruses or enzymes !

Filter sterilisation

45

A tananyag szerkezete:

46

MŰVELETI SORREND MŰVELETI SORREND

Nincs rögzített sorrend, de vannak általános irányelvek:

1. Sejtek elválasztása → szilárd-folyadék elválasztás

más szilárd anyagok: táptalaj-szemcsék, CaCO₃, kristály-fermentáció Jellemző műveletek:

Szűrés

Centrifugálás

47

(ülepítés)

(1/b Sejtfeltárás: csak akkor szükséges, ha a termék intracelluláris)

MŰVELETI SORREND MŰVELETI SORREND

2

.

Koncentráló lépés(ek) → a nagyobb mennyiségben jelen lévő szennyezéseket, elsősorban a vizet választjuk el.

Jellemző műveletek:

Extrakció

48

Extrakció Adszorpció

Membránszűrés Csapadékképzés

(bepárlás, desztilláció)

MŰVELETI SORREND MŰVELETI SORREND

3. Tisztítás → a termék és a szennyező anyagok elválasztása.

Jellemző műveletek: az összes eddigi + kromatográfia

49

4. Végtisztítás (polishing)→ a terméket a kereskedelmi forgalomba hozás előírásainak megfelelő tisztaságig tisztítják.

Jellemző műveletek:

az összes eddigi + kristályosítás + szárítás

Chromatography

Ion exchange –

based on differences on protein surface charge at a given pH

Gel filtration –

differences in mass or shape of proteins

Affinity chromatography –

biospecific interaction between protein and an appropriate ligand e.g.

and an appropriate ligand e.g.

competitive inhibitor or antibody/antigen

Hydrophobic interaction –

differences in surface hydrophobicities of proteins

Chromatofocusing -

differences in isoelectric points

General

Chroma Mobile

Gel filtration

Ion exchange chromatography

Protein molecules are charged except at their isoelectric point (pI).

Proteins are charged differently at the same pH. Charge depends on AA-s.

Positive charge below pI, negative charge above pI

Can interact reversibly with solid matrix with opposite charge due to electrostatic attraction

charge due to electrostatic attraction

Often based on cellulose or agarose with charged groups attached

Having attached to matrix, proteins can elute by changing salt conc or pH, often in gradient.

Ion exchange chromatography

Ion exchange chromatography

Hydrophobic interaction chromatography

7 hydrophobic AAs -found in different proportions on surface in different proteins

Most on internal parts of folded protein Tend to be arranged in patches

Can interact with hydrophobic groups on a column matrix Adding salt increases hydrophobicity of protein

– usually applied to column in high ionic strength solutions.

Eluted by reducing salt, adding detergent or solvent

Hydrophobic matrixes

Often cross linked agarose gels with phenyl groups or

octyl groups attached.

Based on specific interaction between protein and ligand on matrix

Affinity chromatography

protein and ligand on matrix

Biospecific, e.g. enzyme-inhibitor or co-factor, antibody-antigen

Pseudoaffinity ligand with

specificity for particular class of proteins, e.g. some dyes, Protein G

Advantages

High degree of purification possible in single step.

Can separate proteins with very similar chemical

Disadvantages

Can be expensive

Sometimes hard to find good ligand

Affinity chromatography

very similar chemical composition –e.g.

antibodies by using

antigen –affinity chrom.

“Designer” method –less trial and error.

Sometimes hard to displace protein –binds too well to ligand!

Ligand may be destroyed or

leach from column

Kromatográfiás oszlopok

Monoklónális antitest termelő technológiai sor

With permission of Sartorius GmbH

TISZTASÁGI SZINTEK TISZTASÁGI SZINTEK

– Humán injekciós készítmény (kis → nagy dózis) – Humán enterális gyógyszerek

– Állatorvosi gyógyszerek – Élelmiszerek

– Külsőleges gyógyszerek

63

– Kozmetikai készítmények (lemosandó → bőrön maradó) – Technikai, más gyártások alapanyaga

A gyógyszerkönyvi minőség nem mindig a legtisztább, egy kis NaCl ott nem gond, de analitikánál viszont zavarhat

.

1. szint - alap biológiai kockázatú (BSL 1 )

az a biológiai tényező, amely nem képes emberi megbetegedést okozni

2. szint - alap biológiai kockázatú (BSL 2 ) az a biológiai tényező, amely

• képes emberi megbetegedést okozni,

• veszélyt jelenthet

• elterjedése nem valószínű,

• az általa kiváltott betegség eredményesen megelőzhető, vagy kezelése hatásos 3. szint – fertőzésveszélyes (BSL 3 )

A biológiai biztonság 4 szintje - EüM 61/1999 (WHO alapján

3. szint – fertőzésveszélyes (BSL 3 )

súlyos emberi megbetegedéseket képes okozni (akár halálosat),

• komoly veszélyt jelenthet

• szétterjedésének kockázata az emberi közösségben fennállhat,

• általában eredményesen megelőzhető, vagy kezelése hatásos

4. szint - kiemelten fertőzésveszélyes (BSL 4 )

• súlyos emberi megbetegedést okoz, (akár halálosat)

• komoly veszélyt jelent a munkavállaló számára,

• az emberi közösségben való szétterjedésének nagy a kockázata,

• általában nem előzhető meg, vagy nem kezelhető hatásosan

A biológiai biztonság négy szintjére jellemző mikroorganizmusok

I. II. III. IV.

BAKTÉ- RIUMOK

Escherichia coli Lactobacillus sp.

Vibrio cholerae Clostridium tetani Corynebacterium

dyphtheriae

Bacillus anthracis Yersinia pestis

Mycoplasma mycoides

GOMBÁK Saccharomyces Candida albicans

Histoplasma capsulatum

GOMBÁK Saccharomyces cerevisiae

Candida albicans capsulatum Coccidioides

immitis

VÍRUSOK

Vakcinálás-hoz használt

influenza törzs

Hepatitis Influenza

Herpes simplex

HIV

Sárgaláz Creutzfeldt-

Jacob betegség (prion!)

Ebola

Marburg vírus Közép-Eui encephalitis

(agyvelogyulladás) vírus (EU-ban csak

III. szint)