Enzimológia Amiláz enzimek

(1)

Enzimológia Amiláz enzimek

Dienes Dóra

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

(2)

2009 Enzimológia – Amiláz enzimek 2

Keményítő

Termelődése

 zöld növényekben

 legfontosabb emberi szénhidrát-tartalmú táplálékokban:

rizs búza kukorica burgonya

manióka (trópusok) Funkciója

 energia-tárolás

jobb keményítőként, mint glükózként, mert így nem vízoldható (hidegen) és kompaktabb Tárolása

 magokban, gyümölcsökben, gumókban, gyökértörzsekben

 félkristályos keményítő granulákként (kukorica: kb. 2-30 m, burgonya: 5-100 m)

 a kloroplasztban (levél) és az amiloplasztban (gumó, mag, gyökér)

Starch

(3)

Keményítő

Felhasználása

 egyiptomiak

ruhák keményítésére lenszálak szövésénél papirusz ragasztására

 rómaiak

kozmetikai krémekben haj porozására

szószok sűrítésére

 perzsák, indiaiak

édességekhez (halva)

 kínaiak

papír felületi bevonására

 ma

sűrítő

Ragasztó, keményítő, textilipar írezés....

Starch

(4)

Keményítő

Jellemzői

 fehér

 íztelen

 szagtalan

 por Felépítése

 szénhidrát

 poliszacharid, monomere: glükóz

 2 féle glükózpolimer: amilóz, amilopektin

a növényekre jellemző az amilóz/amilopektin arány ۰ rozs: 26% amilóz

۰ kukorica: 22-28%

۰ viaszos tengeri: 1%

۰ „high amylose corn”: 80%

۰ búza: 17-27%

۰ burgonya: 23%

۰ banán: 17%

Starch

http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture34.html

(5)

Keményítő

Amilóz / -amylose

 lineáris

 -1,4

 10-30%

 burgonya DP 1000-6000 kukorica DP 200-1200

 redukáló és nem-redukáló vég

 gyengén vízoldható, micellákat képez

 helikális elrendeződés hajlamos visszaalakulni 2 molekula ütközik

 részlegesen dehidratálódik, kinyúlik

 hidrogén kötések  asszociálódik

 pelyhes csapadék főleg az amilózra jellemző (öreg kenyér morzsásodása)

 jóddal  kék szín

Starch

(6)

Keményítő

Amilopektin / amylopectin

 elágazó

 láncban -1,4

 elágazás csatlakozás -1,6

 70-90%

 elágazás minden 12-30. cukormolekulán

 oldallánc: 15-45 monomer

 DP:akár >10.000 monomer egység

 vízben oldódik, micellákat képez

 jóddal  vöröses lila szín

Starch

http://www.peoriaendocrine.com/diabetes_lecture.htm

(7)

Keményítő

Lebontása a növény által

 lépésről-lépésre monomerré

 -1,4 a keményítő-foszforiláz által

 -1,6 az -1,6-glükozidáz által

Starch



^HPO4 2-



(8)

Keményítő

Lebontása az ember által

 kristályosat nehezen

 rezisztens keményítő: bontás nélkül megy át az emésztőrendszeren

 főzés  emészthetőség 

Starch

http://www.cheng.cam.ac.uk/research/groups/polymer/RMP/nitin/Starchstructure.html

(9)

Keményítő

Élelmiszer-felhasználás / Starch as food

 élelmiszer szénhidrát

 élelmiszer adalékanyag

sűrítő, stabilizáló (pudingok, szószok, salátaöntetek, tészták stb.) rezisztens keményítő

tablettázó segédanyag

 keményítőcukrok (részlegesen / teljesen hidrolizálva) édesítő (pl. üdítőitalokban)

maltodextrinek (dextróz egyenérték, DE 10-20%) – töltőanyag, sűrítő keményítő szörp/szirup (DE 30-70) – édesítő, sűrítő

dextróz (DE 100) – kereskedelmi glükóz

Izocukor, HFS (high fructose syrup) (glükózból glükóz-izomerázzal)

cukoralkoholok (cukrok redukálásával v. fermentációval előállított édesítők)

ált. nem v. kevésbé emelik a vércukrot, alacsony kalória-tartalmúak, nem okoznak fogszuvasodást

Starch

(10)

Keményítő

Starch

http://www.health.gov/dietaryguidelines/dga95/9DIETGUI.HTM

(11)

Keményítő

Ipari felhasználás / Industrial applications

 papíripar

felületi enyvezés  szilárdság, felület simasága, fehérség, nyomtathatóság hullámpapír ragasztó enyv

 enyv-ragasztás

könyvkötés, tapéta, papírzsák, boríték, üveg-cimke ragasztás

 ruha keményítés

sima, ropogó élek, szennyeződések könnyebb eltávolítása

 térkitöltő törékeny áru csomagolásához / „starch-based packing peanuts”

 gipszkarton, álmennyezet (ragaszt és erősít)

 textilipar

pamutszálak bevonása szövés előtt (írezés)

 hintőpor (talkum helyett)

 bioműanyagok

 Bioüzemanyag (etanol)

Starch

(12)

Amilázok

Keményítőbontó enzimek

 endo-enzim:

αlfa-amiláz, elfolyósít ۰ αlfa-1,4 kötést bont

۰ rövidebb láncokat, dextrineket (6-7 monomer) termel, αlfa-határdextrin

 exo-enzimek:

β-amiláz

۰ nem-redukáló végről

۰ maltózt hasít le, határdextrinek maradnak (elágazó amilopektin miatt)

γ-amiláz (emberi bélflórában), amiloglükozidáz/glükoamiláz (mikrobák termelik) ۰ nem-redukáló végről

۰ glükóz egységeket választ le (maltózt csak lassan bontja)

 elágazásoknál α-1,6 kötéseket bont  megszünteti az elágazásokat növényekben: R-enzim, mikrobákban: pullulanáz, izoamiláz

 transzferázok: α-1,4 glikozidkötés bontása után új glikozidkötést hoznak létre

Amylases

(13)

Amilázok

-amiláz / -amylase

 növények (magok csírázása), állatok, gombák, baktériumok (különböző eredetű enzimek!)

 endo-enzim

 anomer konfigurációt megtartó („retaining”)

 amilózból maltózt, maltotriózt szabadít fel

 amilopektinből glükózt, maltózt, dextrineket (-határdextrinek)

 működéséhez Ca²⁺ kell

 emberi

nyálban (emberében van, de pl. ló, kutya, macska nyálában nincs amiláz) ۰ 5 izoenzime ismert

۰ élelem lebontása 1. lépés

۰ kevés cukor, sok keményítő + nyál és rágás  édesebb

۰ nyál -amilázt a gyomorsav inaktiválja (S-tal együtt részben aktív marad) ۰ pH opt. 5,6-6,9

۰ evolúció  több kódoló gén másolat nagyobb arányú keményítő-táplálék fogyasztóknál pl. japánok (sok rizs) 14, pigmeusok (esőerdő vadászat) 6

hasnyálmirigyben termelődik

Amylases

(14)

Amilázok

-amiláz / -amylase

 növények, gombák, baktériumok (Bacillus polymyxa) állatok nem termelik, csak az emésztőrendszer baktériumai

 exo-enzim

 a nem-redukáló végről

 anomer konfigurációt átfordító („inverting”)

 β konfigurációjú maltózt képez

 stabilitáshoz, aktivitáshoz nem kell Ca²⁺

 gyümölcsök érésekor: -amiláz bontás  cukrok  édes íz 

 magokban csírázás előtt aktív

 sörfőzés: -amiláz  árpa csírázáskor maláta készítése Maltóz

 glükóz dimer

 -1,4 kötés a két glükóz között

 maltáz enzim hidrolizálja glükózzá (egyensúlyi reakció)

Amylases

(15)

Amilázok

-amiláz – amiloglükozidáz v. glükoamiláz / -amylase - amyloglucosidase

 exo-enzim

 amilóz és amilopektin nem-redukáló végéről -1,4 kötés bontásával glükózt szabadít fel

 ésterminális -1,6 kötést is bont

 maltózt csak nagyon lassan bontja

 pH opt. 3,0-4,0

 mikrobák, elsősorban penészek termelik Aspergillus, Rhisopus

 magasabb rendű élőlények bélflóraja

Amylases

(16)

Amilázok

Amylases

(17)

Amilázok

Maltáz – -glükozidáz / maltase

 αlfa-1,4 (néha αlfa-1,6) glikozid kötések hidrolízise

 nem-redukáló végről

 maltózt és malto-oligoszachariodokat hidrolizál

 termék: αlfa-glükóz

 csírázó magvak, burgonya

 élesztő, baktériumok, penészgombák

 nyál, hasnyálmirigy, vér, bélnedv

 emberben 4 féle αlfa-glükozidáz maltázok

szukráz/invertáz (szacharóz) és izomaltáz (izomaltóz: αlfa-1,6)

Amylases

(18)

Amilázok

Elágazásbontó enzimek / debranching enzymes

 elágazásoknál αlfa-1,6 kötéseket és

 határdextrint bont

 izoamiláz

csak αlfa-1,6 kötéseket bont, αlfa-1,4-et nem

 Pullulanáz (Aerobacter aerogenez termeli) pullulánt is bontja

pullulán: Pullularia pullulans (ma helyesen: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba) tartalék tápanyaga, glükóz polimer, maltotrióz láncokból α-1,6 kötéssel épül fel (α-1,4 és α-1,6 kötés) (pullulán ehető, ízetlen; felhasználása: élelmiszeradalék, kapszula-

alapanyag)

I-es típus: α-1,6 kötéseket vág maltotriózt szabadít fel

II-es típus: α-1,4 és 1,6 kötéseket is vág (α-amiláz-pullulanáz) maltózt és maltotriózt szabadít fel

neopullulanáz: α-1,4 és α-1,6 kötések bontása után transzglikozilációval új α-1,4 és α-1,6 kötést hoz létre

Amylases

(19)

Amilázok

Aktivitásuk mérése

Az -amiláz aktivitás meghatározásának alapjai

 a redukáló cukrok mennyiségének növekedése

keményítő hasítása  dextrinek  kisebb egységek (maltoteteraóz, maltotrióz, maltóz és glükóz)

új cukor redukáló végek megjelenése

pl. dinitro-szalicilsavas eljárás: 3,5-dinitro-szalicilsav oxidálja a glükóz aldehid csoportját  3-amino-5-nitro-szalicilsav keletkezik  barnás-sárgás szín, fotometriásan mérhető

 a keményítő-jód komplex kék színének intenzitáscsökkenése

amiláz  kezdetben hosszabb molekulájú dextrinek  jóddal barnásvörös szín keményítő teljes lebomlása  az elegy jóddal nem ad színreakciót

 keményítő szuszpenzió viszkozitásának változása

 mesterséges szubsztrát hidrolízise kromofór csoport felszabadulása fotometriásan mérhető

Amylases

(20)

Amilázok

Enzim források

 baktériumok Bacillus Streptomyces Pseudomonas Aerobacter

 gombák

Saccharomyces Pullalaria pullulans Aspergillus

Mucor Rhisopus

Amylases

(21)

Amilázok felhasználása

 sütőipar

cukrok  élesztő C-forrása  CO2

amiláz  a pékáruk térfogata , állaga javul

 élelmiszeradalék: E 1100 sütőipari állományjavító, stabilizáló sertés hasnyálmirigyből

penészgombák által termelt

 textilipar: keményítő bevonat eltávolítása -amilázzal (írtelenítés), bakteriális amilázok

 papíripar

 detergensek: bakteriális amilázok

 gyógyászati, klinikai alkalmazások

maltooligoszacharidokból -amilázzal  tiszta, viszkózus oldat

 csecsemők, idősek, betegek táplálása

nyálmirigy és hasnyálmirigy eredetű rendellenességek indikátorai

 sörgyártás: cukor- és alkohol-tartalom beállítása

 gyümölcslevek: keményítő-tartalmú gyümölcsök (pl. éretlenül szedett alma)

 takarmányok emészthetőségének javítására

Industrial applications

(22)

Amilázok felhasználása

 kukorica keményítő bontása

glükóz eá. -amilázzal, pullulanázzal, amiloglükozidázzal

izocukor eá. -amilázzal, amiloglükozidázzal, glükóz-izomerázzal HFS eá. (fruktóz 55% ioncserével)

keményítőszörp eá. (glükóz + dextrinek, DE kb. 40%; édesipar: cukorkák eá.) maltóz szirup eá. -amilázzal

Industrial applications

(23)

Amilázok felhasználása

Glükóz előállítása (lsd. Mezőgazd.Iparok)

 kukorica keményítő kinyerése

a kukoricaszemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát

 állati takarmány/csíraolaj kinyerése a csírátlanított szemeket megőrlik a keményítőt elkülönítik, tisztítják

 előhidrolízis, elfolyósítás

105-110°C, 5 perc (gélesítés)  <1 DE

30-40% sz.a. szuszpenzióhoz α-amiláz (B. licheniformis) (+ 20 ppm Ca²⁺) 85-95°C , pH 6,0, 1-2 óra  8-18 DE

 elcukrosítás

hígítás  10-20%

amiloglükozidáz (A. niger) + pullulanáz (Bacillus)  további hidrolízis  glükóz 60°C, pH 4,5, 48-96 óra  95 DE

szűrés

 termék: 95-98% glükóz

Industrial applications

(24)

Keményítő

Dextróz egyenérték

 a keményítő hidrolízis mértéke

 elbontott glikozidkötések száma / kezdeti összes [%]

 redukáló cukor glükózban kifejezve / teljes szénhidrát mennyiség [%]

 a szárazanyag %-ában számított redukálóképesség

 a keményítő hány %-a van dextróz (glükóz) formában

 DE = 180/(162 x n + 18) x 100 ahol n az átlagos DP

glükóz DE 100 maltóz DE 53 maltotrióz DE 36 keményítő DE közel 0

fordítva arányos a polimerizációs fokkal, a maltodextrinek móltömegével

Starch

(25)

Amilázok felhasználása

Industrial applications

(26)

Amilázok felhasználása

Industrial applications

(27)

Amilázok felhasználása

Izocukor élőállítása

 kukorica keményítőből eá. glükózoldat tisztítása, töményítése (40% sz.a.)

 a glükóz-oldatot immobilizált glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át (pH 7-8)

intracelluláris E  nehéz kinyerni  immobilizálják

az enzimet Bacillus coagulans baktérium tenyésztésével állítják elő (Novozymes) xilóz alapú fermentáció (xilán és xilóz tartalmú búzakorpán)

 glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) indukciója

egyensúlyi reakció  a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik elméletileg max. 50% fruktóz

rövidebb reakcióidő  kevesebb melléktermék, de így csak 42% fruktóz

 oldatot tisztítása

töményítése bepárlással kb. 64%-osra

 glükóz és fruktóz kromatográfiás elválasztása

 fruktóz bekeverése a 42%-osba

 HFCS (high fructose corn syrup) ált 55% fruktóz

Industrial applications

(28)

Amilázok felhasználása

Industrial applications

(29)

Amilázok felhasználása

Izocukor

 glükóz-fruktóz elegy tömény vizes oldata

 élelmiszeriparban édesítőszerként

 nehezen kristályosodik

 erős nedvszívó képességű

 megakadályozza a készítmény vízvesztését

 Mo.: Szabadegyháza, Hungrana Kft.

Európa legnagyobb kukoricafeldolgozója (3.000 t/nap feldolgozási kapacitás)

Európa legnagyobb izocukor-kvótája (220.000 t/év)

EU termelés 27%-a

Industrial applications

(30)

Amilázok felhasználása

http://en.wikipedia.org/wiki/Fructose

Industrial applications

(31)

Amilázok felhasználása

Industrial applications

(32)

Amilázok felhasználása

http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp

Keményítő savas / enzimes bontása (Keményítőszörpök)

 savas katalízissel (régebben) 28-55 DE

 elfolyósítás savval, elcukrosítás amiloglükozidázzal

 további lebontás

 hőstabil amiláz felfedezése

 még több lehetőség a termék összetételére

 enzimes, enzimes technológia

 porlasztva szárítható termékek (pl. kávékrémporba)

 lekvárokban magas cukor-tartalom

 mikrobák növekedését gátolja

glükóz szirup kedvezőbb mint a szacharóz, mert kevésbé édes

 hagyományos felhasználásuk: keménycukorkákban

 később: italokban (sör) magas maltóz-tartalmú szirupok felhasználása

Industrial applications

(33)

Amilázok felhasználása

Sütőipar

 az élesztő erjeszti a cukrokat

 alkohol és CO2 keletkezik

 a tészta megkel

 az élesztő termel amilázokat, de hosszadalmas (hosszú idejű kelt tészták, savanyú kenyerek)

 amiláz hozzáadás  a keményítőszemcséinek lebontása kismolekulájú dextrinekre  az élesztő tovább tudja bontani  gyors

 csíráztatott árpa (maláta) vagy gombaeredetű α-amiláz

 megnő a tészta térfogata, és javul a bélzet textúrája, rugalmassága + öregedés késleltetése

 ! már csekély túladagolásuk ragadós, gumiszerű tésztát eredményez α-amiláz hatására keletkező elágazó DP 20-100 maltodextrin miatt

elágazásbontó enzim, pl. pullulanáz adagolása

Industrial applications

(34)

Amilázok felhasználása

http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp

Textilipar

 a fonalat szövés előtt dextrinnel vagy keményítővel vonják be: írezés

 a felületet simává teszik

 növelik a szilárdságot

 a kész textíliákból amilázzal eltávolítják: írtelenítés

 szelektív eltávolítás, a rostok nem sérülnek előmosás

۰ nedvesítés és a nem keményítő anyagok eltávolítása impregnálás az enzimoldattal

۰ 65-70 / 75-80°C

keményítőhidrolízis (már az impregnálásnál is)

۰ 2-16 óra reakcióidő, pH 6-7 (az enzim optimumán), 70-75 / 90-110°C utómosás: az enzim és a hidrolízistermékek eltávolítása

۰ szintetikus detergens + NaOH, 95-100°C, sav hozzáadás a lúg semlegesítésére

 hőtűrő bakteriális amiláz

Industrial applications

(35)

Amilázok felhasználása

Papíripar

 primer rostok feldolgozásakor (fából kinyert cellulóz) felületi kezelésére vagy ragasztóanyagként alacsony viszkozitású, nagy molekula tömegű keményítő-származékokok, dextrin

ennek előállítása: -amilázzal

 szekunder rostok felhasználásakor (hulladékpapír)

amilázos kezeléssel a rostok felülete megtisztítható

az előző feldolgozás során alkalmazott keményítő alapú segédanyagoktól

 a rost–rost kapcsolat fokozódik

 erősebb papírokat lehet előállítani

 javulnak a nedvesedési tulajdonságok

 a rostosítás gyorsul

Industrial applications

(36)

Amilázok felhasználása

Juice Industry

► Amylase AG XXL Glucoamylase

► Biocip Membrane Glucoamylase / Polygalacturonase / Cellulase Brewing Industry

► Attenuzyme Glucoamylase

► Ceremix Plus Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase

► Cerezyme Sorghum Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase Starch industry

► DextrozymePullulanase / Amyloglucosidase

► Liquozyme Alpha-amylase

► Maltogenase Maltogenic amylase

► Termamyl All except Termamyl Classic Alpha-amylase

► Liquozyme Alpha-amylase Baking industry

► Fungamyl Super MA Alpha-amylase / Xylanase

► Novamyl Maltogenic amylase Alcohol Industry

► Saczyme Glucoamylase

► SAN Extra Glucoamylase

► SAN Super 360L Glucoamylase / Alpha-amylase / Protease

► Spirizyme Glucoamylase

► Liquozyme Alpha-amylase

► Novozym 50004 Glucoamylase Textile industry

► Aquazym Alpha-amylase

► Novoprime D 659 Alpha-amylase Detergent industry

► Duramyl Alpha-amylase

► Stainzyme Alpha-amylase

► Termamyl Alpha-amylase Pet food industry

► Extruzyme Pro Alpha-amylase