1.ENZIMMÉRNÖKI ALAPISMERETEK

2001 2001

1.ENZIMMÉRNÖKI ALAPISMERETEK

“Kevés fejezete van a chemiának, amely a legutolsó néhány év alatt olyan nagyot haladt volna, mint éppen az enzimeké. Éppen ezért a vegyész lépten-nyomon érzi, hogy megismerésük és a velük való bánásmód manapság már nélkülözhetetlen”

Zemplén Géza,1915

Az enzimek és gyakorlati alkalmazásuk.

A kir.Magyar Term.Tud . Társulat kiadása 349 oldal

BIM SB 2001 BIM SB

e n z u m h = élesztőben 2001

1878 Kühne

A fehérjék speciális csoportjai és biológiai funkcióik:

Regulátor

Regulátor fehérjékfehérjék

lac-represszor RNS szintézis interferonok vírus rezisztencia

inzulin glükóz metabolizmus növ. hormon

Transzport fehérjék

laktóz permeáz sejtmembrán transzport mioglobin O₂ - izomban

hemoglogin O₂ - vérben Védőfehérjék

antitestek (abzymek) idegen anyag -komplex

trombin véralvadás

2001

Toxinok 2001

B.thuringiensis biol. Inszekticid Cl.botulinum ételmérgezés Tartalék ta.fehérjék

ovalbumin tojásfehérje

kazein tejfehérje

zein kukoricacsíra

Kontraktil fehérjék

dynein cilia, flagella Szerkezeti fehérjék

kollagén izületek, inak glikoproteinek sejtfal

ENZIMEK reakciókatalízis

chaperonok prionok

Regulátor

Regulátor fehérjékfehérjék

lac-represszor RNS szintézis interferonok vírus rezisztencia

inzulin glükóz metabolizmus növ. hormon

Transzport fehérjék

laktóz permeáz sejtmembrán transzport mioglobin O₂ - izomban

hemoglogin O₂ - vérben

Védőfehérjék

antitestek (abzymek) idegen anyag -komplex

trombin véralvadás

katalitikus hatás ^{BIM SB}₂₀₀₁

2001 2001

BIOKATALÍZIS és RNS

RNS - világ ® RIBOZIMEK

&

ATP, NAD⁺, CoA, (koenzimek) tRNS

RNaseP 377 bp ~ 125 kD a fehérjéje csak 119 AS ~ 14 kD

Enzimek - katalitikus hatású FEHÉRJÉK sejtnek 15-55 % sz.a.

BIM SB 2001 BIM SB

2001

Gyorsan sz aporodó Escherichia coli össz e té te l e (W atson , 1970 n yom án )

ÖSSZETEVÕ VEG YÜLET CSOPORT

% A

SEJTÖMEG B E N

ÁTLAG MÓLTÖME

G

DB /SEJT FAJT A/SEJ T

H2O 70 18 4*10¹⁰ 1

SZERVETLEN IONOK:

K⁺,Mg^{2 +},Ca^{2 +},Fe^{2 +},Cl^- PO4

4 - ,SO4 2 -

1 40 2,5*10⁸ 20

Szénhidrátok és

prekurzoraik

3 150 200

Aminosavak és

prekurzoraik

0,4 120 3*10⁷ 100

Nukleotidok és

prekurzoraik

0,4 300 1,2*10⁷ 200

Lipidek és prekurzoraik

2 750 2,5*10⁷ 50

Egyéb kis

molekulák

(hem,kinonok,….)

0,2 150 1,5*10⁷ 200

Fehérjék 15 40000 10⁶ 2-

3000 Nukleinsavak

DNS RNS

1 2,5*10⁹

500000

4 3*10⁴

1 1

2-3000/ sejt kül.enzimfeh.

2001 2001

A + B AB* P

* S T.

* G

H*= D + D D

B A

AB

C C K C

= ^*×

*

h C kT C

C dt k

dP

AB B

A r

= *

=

kT h k C

C

K C ^r

B A

AB =

= ^*

*

* r *

*

* H T S

kT h RTlnk RTlnK

G =- =- =D - D D

RT E RT

H R

S

r e e konst e h

k kT

*

*

* -D -D

D

×

»

×

=

T az abszolút hõmérséklet (Kelvin fok)

k a Boltzmann állandó (1,37.10-16 erg/oC) h a Planck állandó ( 6,62.10-27)

( )

( )

( )

( )

b

Eyring: 30-as évek, átmeneti állapot

AKTIVÁLT KOMPLEX ES*

FUNKCIONÁLIS DOMAIN-EK

SZUBSZTRÁT KÖTŐ HELY

REGULÁTOR DOMAINEK:

Me

modulátor (INHIBITOR,AKTIVÁTOR,S,P) Kovalens módositás:

foszforilezés glikozilezés proteolizis

Katalitikus domain AKTIV CENTRUM

lehetnek azonosak is

BIM SB 2001

SZUBSZTRÁT KÖTŐ HELY

Zsák,zseb

rendszerint töltés illetve hidrofób

a kötést stabilizálhatja nemkovalens kölcsönhatás

csak egy kis felület a protein molekulán!

Az enzim-katalizis általános esetei: 1. sav-bázis

modern elméle Linus Pauling 1946 2.kovalens katalizis Haldane 1930 3.fém ion katalizis Hatások, amelyek felelősek ill. jellemzik az enzimkatalizis(ér)t:

proximitási effektus

orientácós effektus kulcs – zár hasonlat indukált illeszkedés Daniel Koshland-konformációváltozás

ENTRÓPIACSAPDA

2001

REAKTIV CSOPORTOK fehérjeszerkezet

MASTERSLIDE

enztul

S

szabad E +

ES ^komplex

szabad E

+

termékek

KULCS

ZÁR

BIM SB

KULCS-ZÁR HASONLAT 2001

Orientációs effektus

A sztereospecifitás alapja

2001

http://www.chem.ucsb.edu/~molvisual/ABLE/induced_fit/index.html

Izocitrát dehidrogenáz 2001

BIM SB

Asp -COO^- 2001

Cys -SH

Glu -COO- & -CONH₂ His HC C imidazol

+HN NH CH Lys e - NH₂

Met CH₃ –S - Ser -OH

Thr CH₃CHOH -

láncvégi NH₂ és COO^-

elektrosztatikus kölcsönhatás

H - kötések

C O...H O C O...H N REAKTÍV CSOPORTOK...

2001

Fehérjeszerkezet

BIM SB 2001

Aktív centrum kialakulása

2001

ENZIMEK ELŐNYEI

NAGYOBB REAKCIÓSEBESSÉG 10⁶-10¹²* ENYHÉBB REAKCIÓKÖRÜLMÉNYEK

NAGYOBB REAKCIÓ-..+ SPECIFITÁS REGULÁLHATÓSÁG

ENZIMEK TULAJDONSÁGAI

CSAK TERMODINAMIKAILAG LEHETSÉGES REAKCIÓK DG <0

REVERZIBILIS REAKCIÓK de:eltolás, elvétel...

DENATURÁLHATÓAK T, pH, ionerősség, oldószerek SPECIFIKUSAK S-specifitás

csoport-specifitás sztereo-specifitás régió-specifitás

APOENZIM + KOFAKTOR HOLOENZIM

FEHÉRJE inaktív

FÉMION

Mg,Ca,Zn, Fe,Cu,Mo

KOENZIM

Prosztetikus csoport stabil kovalens kötés.

FAD(H₂), Hem, Piridoxal-P(B₆)

Koszubsztrát

Ciklikus regenerálás NAD(H), ATP

BIM BSc

2001

ENZIMEK ELNEVEZÉSE

1. S – után urea + viz CO₂ + 2NH₃

ureáz

2.Reakció (és S) után EtOH AcO AcOH

alkohol-dehidrogenáz

S-név + áz

(S-név)+reakciónév+ áz

3.Triviális nevek: + -in

pepszin, tripszin, rennin fehérjebontók

4. IUB IUPAC 1964,1972,1978 Enzyme Commission IUBMB

ENZIMEK ELNEVEZÉSE

BIM SB 2001

E.C.1.1.1.49. D-glucose-6P: NADP 1-oxydoreductase

a reakció mibenléte koszubsztrát

katalógusszám

szubsztrát

a támadás helye az 1 C-atomon van

2001

DataBank

BIM SB ENZIMKINETIKA 2001

Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1 mmol szubsztrátot alakít át vagy 1 mmol terméket képez 1 perc alatt adott reakció

körülmények között.

E + S P + E mol/dm³!!!!

E/tf E/mg fajlagos aktivitás

MIÉRT NEM MÉRHETŐ MIÉRT NEM MÉRHETŐ? ?

Michaelis és Menten SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.

hatalmas enzim mennyiség nKat = 10^-9 Kat

1 Kat = 6*10⁷ U, 1U =1.6*10^-8 Kat, 1U= 1/60 mKat

Michaelis-Menten kinetika ₂₀₀₁

E + S ES E + P

k₁ k_-1

k₂ k_-2

(ES) S.E k

K k

1 1

s = ^- =

feltételezések: *k_-2 =0

*első lépés gyorsan egyensúlyra jut= RAPID EKVILIBRIUM

*stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható

*egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc használható

S> >E₀ vagyis E₀ / S < <1

k₁SE = k_-1 (ES)

az (ES) disszociációs állandója

V dP

dt k (ES)₂

= =

E + ( ES ) = E

a teljes reakciósebesség:

anyagmérleg osszuk el ezt a kettőt egymással

BIM SB

Michaelis-Menten kinetika

(ES) S.E k

K k

1 1 s = ^- =

V E

k (ES) E (ES)

o

=

+

V E

k S K E E S

K E

o

2 s

s

=

+

S K

S K

1 S K

S E

k V

s s

s o

2 = +

+

=

V_max = k E_{2 o}

V dP

dt k (ES)₂

= =

Rendezzük át!

Michaelis-Menten kinetika

V V

S K 1 S

K

max

s

s

=

+

V V S

K S

max

s

= +

V V

S K 1 S

K

max

s

s

=

+

E O

H o

H o

K K

E H O K

E H K

E E O

K E H K

E O

. . . .

. . 1

. .

+ +

+

+ terméket

adó komplexek

összes komplex

terméket nem adó komplex szabad enzim

MEMO

M és M

Leonor Michaelis 1875-1949 Maud Menten

1879-1960

BRIGGS-HALDANE KINETIKA ^{BIM SB}

2001

( )

( ) ( ) ( )

( )

dt k dP

ES k

ES k

ES dt k

ES d

ES k

ES dt k

dS

2

2 1

1

1 1

=

- -

=

+ -

=

- -

S > > Eo vagy Eo / S << 1 és

(k₁ES > k_-1(ES) ill. k₁ES > k₂(ES))

pre-st.st.

S

P

(ES)

E S₀

E₀

0 idõ

kvázi st.st.

d(ES)/dt =0 steady state

E + S ES E + P

k₁ k_-1

k₂ k_-2

BRIGGS-HALDANE KINETIKA

( )

( )

( )

dt ES d

2 1

1 - - =

= _-

K_m=(k_-1 + k₂) / k₁

E +(ES) = E_o

( )( )

( ) (

)

2 1

1

k k

ES ES k

ES k

k ES

k

= +

+

=

- -

Michaelis állandó

S K

V S S

K

S E V k

m max

m o 2

= +

= +

DISZKUSSZIÓ

2001

Michaelis -Menten Briggs-Haldane

V V S

K S

max s

= + ^{V V}

S

K S

max

m

= +

K k k

k

k k

k

k K k

m k

1 2

1

1 1

2 1

s

2 1

= +

= + = +

- -

ha num(k₁)> >num(k₂) a két konst. azonos!

V=(V_max/K_S)*S

1.rendû tartomány

0.

rendű

tartomány V_max= k₂E_O

V

K_m ; K_S S

BIM SB 2001

V=(V_max/K_S)*S

1.rendû tartomány

0.

rendû

tartomány V_max= k₂E_O

V

K_m ; K_S S

DISZKUSSZIÓ

S << Ks

Ha S >> Ks derékszögű hiperbola

látszólagos elsőrendű sebességi állandó

S E k S K E

V k _{0 0}

S

2 = ¢

»

katalitikus effektivitás

L-B, L-H, E-H ábrázolások

2001

-1/K

1/S

tga=K_m/V_max

1/V

1/V_max

1 1 1

V V Km V S

= +

max max

*

tga=1/V_max

S/V

S K

/V

K

S V

Km

V V S

= +

max max 1 *

V

V/S V_max

tga=-K_m

V_max/K_m

S m V max K

V

V = -

V

értelmezése

V₀=

( ^dS/dt )

S

t

P

t

V₀=

( ^dP/dt )

A M A M - - M és B M és B - - H egyenletekben H egyenletekben

V kezdeti reakciósebességet jelent!!!

V kezdeti reakciósebességet jelent!!!

A k

meghatározása és V

E

-függése

V_max3=k₂E_O3

V_max2=k₂E_O2

V_max1=k₂E_O1

K_m S E_O1 E_O2 E_O3 E_O

V

tg a= k

A kinetikai paraméterek értelmezése ^{BIM SB} 1 2001

A kinetikai paraméterek értelmezése 2

2001 k₁ 10⁷-10¹⁰ dm³mol^-1min^-1

[max. érték(10¹¹) kis molekulák diffúzió-sebessége ] k^-1 10²-10⁶ min^-1

k² 50-10⁷ min^-1

K_m 10^-6 - 10^-2 mol/dm³

REVERZIBILIS REAKCIÓK 1

BIM SB 2001

biopolimer hidrolízisek - nagymértékben a jobboldali irányba eltolt egyensúllyal rendelkeznek, olyannyira, hogy gyakorlatilag k_-2 valóban elhanyagolható.

De például a glükóz fruktóz (glükóz izomeráz) gyakorlatban is egyensúlyi reakcióként viselkedik

E + S ES E + P k₁

k_-1

k₂

k_-2

1/K_S K_P

V K V

K

V K

V K

k k

k k K

maxs ms maxp

mp

maxs mp maxp ms

1 2 1 2

= = = eq

- -

HALDANE összefüggés

REVERZIBILIS REAKCIÓK 3

2001

E

MI TÖRTÉNIK?

S → P vagy P → S

?

S

P

V

= V

- V

= k

(ES) - k

(EP)

V

V S P

K

K 1 P

K S

V S

K V P

K 1 S

K

P K

netto

maxs

eq

ms

mp

maxs

ms

maxP

mP

ms mP

=

æ -

èçç ö

ø÷÷

æ +

èçç ö

ø÷÷ +

=

-

+ +

MITŐL FÜGG? K

, S , P értéke