FLUORESZCENS IN SITU FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ HIBRIDIZÁCIÓ

(1)

FLUORESZCENS IN SITU FLUORESZCENS IN SITU

HIBRIDIZÁCIÓ HIBRIDIZÁCIÓ

Készítette: Hajdu Csilla

(2)

Módszer elve Módszer elve

Fluoreszcens Fluoreszcens

festékkel jelölt festékkel jelölt

oligonukleotid próba oligonukleotid próba

a sejt a sejt

morfológiájának morfológiájának változása nélkül változása nélkül

bejut a sejtbe, ahol bejut a sejtbe, ahol

specifikusan köt a specifikusan köt a

komplementer komplementer

target target

szekvenciához szekvenciához

(3)

Alkalmazása Alkalmazása



Mikroorganizmusok gyors és pontos Mikroorganizmusok gyors és pontos

mennyiségi és minőségi meghatározásra mennyiségi és minőségi meghatározásra

alkalmas alkalmas



Speciális gének expressziójára Speciális gének expressziójára



Morfológiáról, szerkezetről,térbeli Morfológiáról, szerkezetről,térbeli

elhelyezkedésről ad információt

(4)

Alkalmazásának előnyei Alkalmazásának előnyei

 Látható, de nem tenyészthető Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálata mikroorganizmusok vizsgálata

 Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a

hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebb

fluoreszcencia intenzitása kisebb

 Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálható

többféle mikróbaközösség vizsgálható

 mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatók

termelését végző sejtek detektálhatók

(5)

Alkalmazásának hátrányai Alkalmazásának hátrányai

 Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis intenzitású jelet kapunk

intenzitású jelet kapunk

 Élő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetniÉlő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetni

 Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) autofluoreszceniiája gondot okoz

autofluoreszceniiája gondot okoz  speciális speciális szűrők

szűrők

 rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségű

hozzáférés nem azonos valószínűségű

 Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny

sávú filter) sávú filter)

(6)

Hibridizáció menete Hibridizáció menete

1. A minta fixálása 1. A minta fixálása

• Sejt átjárhatóvá tételeSejt átjárhatóvá tétele

• Sejt épségének fenntartásaSejt épségének fenntartása

• RNS-ek védelmeRNS-ek védelme

2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez 2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez

rögzítés rögzítés

• Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre

cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50,

80, 100%-os) 80, 100%-os)

(7)

Hibridizáció menete Hibridizáció menete

3. Hibridizáció 3. Hibridizáció

• A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer próba mintához adása

próba mintához adása

4. A nem hibridizált próba eltávolítása 4. A nem hibridizált próba eltávolítása

mosással mosással

• 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel mosás, majd szárítás

mosás, majd szárítás

5. A minták értékelése mikroszkóppal 5. A minták értékelése mikroszkóppal

• Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos mikroszkóppal, kamerával a képek

mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálása

digitalizálása

(8)

Fluoreszcens festékek Fluoreszcens festékek

 Fluoreszcein származékok (pl.: Fluoreszcein származékok (pl.:

fluoreszcein izotiocianát) fluoreszcein izotiocianát)

 Rhodamin származékokj(pl.: Rhodamin származékokj(pl.:

tatrarhodamin izotiocianát) tatrarhodamin izotiocianát)

 Cianin származékok: Cy3 – Cianin származékok: Cy3 – rRNS-hez kötődik, gerjesztés:

rRNS-hez kötődik, gerjesztés:

550 nm, emisszió: 570 nm 550 nm, emisszió: 570 nm

 DAPI – DNS-hez kötődik, DAPI – DNS-hez kötődik,

gerjesztés: 358 nm, emisszió:

461 nm 461 nm

RNS-hez is kötődik: emisszió kb.:

400 nm 400 nm

(9)

Hibridizált

Hibridizált Escherichia coli Escherichia coli

(10)

Hibridizált

Hibridizált Escherichia coli Escherichia coli

(11)

DAPI-val festett

DAPI-val festett Trichosporon Trichosporon cutaneum

cutaneum

(12)

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum

Saccharomyces cereviciae

Bacillus subtilis

(13)

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

Bacillus subtilis

(14)

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae

Bacillus subtilis

(15)

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

(16)

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae

(17)