A cyclophilin-D és az NAADP szerepének vizsgálata a Ca
2+-mediált folyamatokban
Doktori tézisek
Dr. Mándi Miklós
Semmelweis Egyetem
Szentágothai János Idegtudományok Doktori Iskola Funkcionális Idegtudományok
Témavezető:
Hivatalos bírálók:
Szigorlati bizottság elnöke:
Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Ádám Veronika
Prof. Dr. Sümegi Balázs Prof. Dr. Bánhegyi Gábor Prof. Dr. Ligeti Erzsébet
Prof. Dr. Liposits Zsolt Dr. Sőti Csaba
Budapest, 2011
Bevezetés:
A cal cium az eg yi k l egfont os abb és legso kold alú bb m áso dl ago s hírvivő, mel y számt al an s ejt en bel üli és sejtköz ötti fol yam at szab ál yoz ás áb an j átszik al apv ető szerepet. A cal cium k on cent ráci ójában b ekö vetk ező v áltoz áso k mintáz at át sz ámo s ex tracel lul ari s faktor, v al ami nt tö b b int racell ularis máso dl ago s hírvivő útvon al szo ros an befol yás olja. A calci um -jel át vit el al apj át a cal ciu m ex tracell ul ari s t érbe, illet ve a külö nböző int racellul aris organ ell umok b a (p l. endo plazm ás/ szarko plazm ás reti cul um, lizoszó ma, mitoko nd rium ok, Go lgi-m em brán , sejt mag) tö rt énő k omp artm ent aliz áci ój a és szignál-vez érelt fel szab adít ás a kép ezi. A nik otin sav-ad eni n di nukl eotid fosz fát (NAADP) eg y ol yan új int racell ularis másodl agos hí rvivő m olekul a, mel y fők ént a s av as Ca2 + rakt árak ból (pl . lizoszómákból és m ikro szóm ákb ól) tört énő Ca2 + felsz ab adu lásb an v esz részt. Az NAADP -ind uk ált C a2 +- fel szabadul ás általáb an t érben és időb en körülh at árolt Ca2 +-sz ign ált hoz létre, mel y g yak ran lo káli s fol yam ato k szab ál yoz ás áb an v esz részt (pl. p an creas β- sejt ek in suli n-szek réci ója, n eurit-növ ek ed és, il l. n eu rotranszmit terek szek réci ója), de so k es et ben r yan odi n - ill. inozito l-1,4 ,5 -trifo szfát (IP3) recept oroko n keresztül tö rt énő Ca2 +-in duk ált C a2 +-felsz abu lással tov aterj eszt ett és generalizált C a2 +-jel ek kiv áltására is szol gálhat (pl . p et es ejt megt erm ék en yít és es et én ).
Az intracellul aris Ca2 +-h om eoszt ázisb an a mito kon dri um ok sok kal összet ett eb b szerep et j átszan ak, mi nt eg ysz erű C a2 +-eln yelők, és ezzel összh an gban a mit okon dri áli s m atrix Ca2 + ko ncent ráció ján ak változásai számos mit oko nd riális fun kci ót befo l yásol nak (pl . a Sz ent g yö rg yi -Krebs cikl us ku lcsfonto ss ágú enzimei n ek szabál yo zása, ill etv e a mitoko nd riális perm abilit ás tranzí ci ós p órus m eg yn yi t ás a). A mit oko nd riális tranzíci ós pó rus reverzibil is v ag y i rrev erzibilis megn yílás a akk or köv et k ezik b e, h a a külön böző in tra- és ex tracellul aris j el átviteli ut ak, v al ami nt a kü lön böző met abol iku s v áltoz áso k em el kedett ROS-t erm elést v agy k ifej ezetten em elk ed ett m at rix Ca2 +, ill etv e sz ab ad foszfátio n szint et eredmén yez nek. A c yclo phili n-D (C yp D) a mito kon dri áli s p ermeabilit ás -tranzí ció s pó rus (mP TP) megn yit ás át elősegítő, calci um -fü ggő sz abál yo zó feh érj e.
Célkit ű zések:
#1 Munk án k elsődl eges célj a a c yclop hilin -D-nek (C yp D) a Ca2 +-ind uk ált perm eabilit ás -tranzíciób an bet öltöt t sz erep én ek tiszt ázása, ill etv e ez en fun kci ój án ak a s ejt bio en ergetik ai áll apo tával mut atot t összefü ggés ein ek vizs gálat a. Előszö r azt i gazolju k, ho g y szubszt rát-hián yos áll ap otb an a mitoko nd rium ok val óban fo kozott érzék en ys éget mu tat n ak a C a2 +-i ndu kált perm eabilit ás -tranzícióra és bem ut atju k, ho g y a C yp D gen etik us d el éci ój a has onló fokú védelm et j el ent, mint c ycl os pori n-A alk alm azása WT szubszt rát- hián yos mit oko ndriu mokb an . Ezt kö vetően parall el köv etj ük Ru36 0, ill etv e szétk ap cs olósz er j el enl ét éb en a m it okon dri umo k C a2 + fel v étel ét és duzzad ás át. Eredm én yeink al apj án fel merült az a k érdés , vaj on a m agas kon cent ráció jú C a2 + a mit oko nd rium ok felszín én kötődv e hat , v ag y eg y RuRed /Ru3 60 -től fü ggetl en m echaniz muss al b elép a mitoko nd rium ok bels ej éb e. A k érd és eld önt és e célj áb ól in situ mit oko nd riumo k Ca2 +-felv evő kép es ségét vizs gálj uk Ru3 60 és Ruth eni um Red jel en lét éb en. Kö vet kező lép ésb en a k ülön b öző légz ési l án cot alkot ó kom pl ex ek Ca2 +-in duk ált duzzad ásb an játszo tt szerep ét vizs gáljuk Ko mpl ex I., III. és IV.
gátl ószerein ek alk al mazásával . Végül megvizs gálju k a C ypD d eléci ójának elt érő hat ás át in sit u neu ro nális és ast roc yt a mit oko nd rium ok duzzad ás ában.
Tov ább á b em utatju k, ho g y a c ycl o philin -D deléci ója a neuron ális mitoko nd rium ok ex citotox ikus (glut am at e-gli cin ) h at ás ra b ek övetk ező k ezd eti duzzad ás án ak i dőb en tört énő el hal aszt ás a mell ett a k ésői neu ron áli s cal cium deregul ációv al szem ben is v éd elm et bizt osít.
#2 Más felől , a s ejtpl az máb an tö rt énő Ca2 +-j el átvit elt t eki ntv e fő cél unk az NAADP -m edi ált fo l yam at ön álló Ca2 + kiáramlási út v onalk ént val ó defini ál ás a máj sej t mikroszó mákb an. Elsők ént m egh at ározzuk, h o g y az aktí van töltöt t mikroszómális Ca2 +-rakt ár thapsi gargi n-, de nem b afilom yci n A1 -érzéken y. A k öv etkező l ép és ben i gazo ljuk, ho g y az NAADP való b an k ép es Ca2 +-fel szabadít ásra máj mi kroszóm ákb ól és ö sszehason lítju k az NAADP, az IP3 és a cADPR Ca2 + mobiliz áló k ép es ségét . Ezt kö vetően b emutat juk , ho g y nin cs k ereszt-d esz en zitizáci ó az NAADP , az IP3 és a cADP R között , ann ak
bizon yít ék aként, ho g y mi ndh árom Ca2 +-m obilizáló másodl agos hírvi vő kül ön - külön recep toron k ereszt ül fejti ki h atás át. Az NAADP -d ep end ens Ca2 +- kiáraml ás tul ajd ons ágai ra fó kusz álv a megadj uk az NAADP dózis -h at ás görbéj ét , tov áb bá bemut atj uk az NAADP -fü ggő Ca2 +-ki áraml ás C a2 + kon cent ráció -fü ggés ét és p H-fü ggés ét máj mi kro szóm ákban. Gerin ces szövet b en elsők ént i gazoljuk az NAADP-i ndu kált C a2 +-felszabadul ás eg yed ül álló i n aktiv ációs s émáját , m el y s orán önm agáb an C a2 +-ki áraml ást n em okozó dózisb an al kalmazott NAADP k ép es eg y k ésőbbi, tel ítő menn yi ségb en alk alm azott NAADP hat ás át m eggát olni. Tov ábbi akb an a feltölt ött mikroszóm ák at t h ap si garginn al és b afil om ycin A1 -g yel in kub áltu nk, ho g y al átámaszthassu k azt az el képzel ést , mel y szerint mi kro szómális C a2 + rakt árak ból tö rt énő Ca2 + fel szab dul ást a “on e-po ol” m od ell el l eh et leírni.
Végül, az NAADP medi ált C a2 + kiáramlás farm akol ó gi ai tulaj don ságain ak meghat ároz ásáv al erős bizo n yít ék át adju k ann ak, h o g y az NAADP v aló b an önálló és az IP3-tól és a cADPR -tól fü ggetl en ut at képv is el máj mikroszóm ákb an .
Módszerek:
Agyi mito ko ndri umo k izol álás a va d típusú (WT ) és cycl ophili n-D gén ki ütött (K O) - C5 7Bl/6 egerekből
Az azono s kö rül mén yek között t artott , c ycl ophil in -D-re n ézve gén kiüt ött (KO) és v ad tí pus ú (WT) egerek Dr. Nik a Danial (Howard Hu gh es Medi cal Ins titut e) és Dr. Ann a S chin zel (Dan a-Farb er C an cer In stitut e, Harv ard Medi cal S chool ) szí ves aj ánd ék ai volt ak . Az egerek et 8 n emz ed ék en át k ereszt ezv e ten yé szett ék mi előtt i ntéz etü nkb en azono s él et korú, WT és KO áll atok ból ag ys zöv et et n yertü k ki mit oko ndri áli s izol álás, v al amint ast ro c yt ák és n eu ro nok s ejtt en yészt és e célj áb ól. A kís érlet ei nk so rán használ t non - szinap tiku s ag yi m itoko dri umok at fel nőtt (8 7-115 n ap os), hím, C yp -D szempo ntj ábó l WT és KO egerek ag yáb ól P ercol l-grád iens s egíts égév el prep arált uk Sims és társ ai (19 90 ) leí rása szerin t, am it Ch inopo ulo s C. és társai (200 3) sz erint kis mért ék ben mód osított unk . Min den áll atkí sérl et et az Eg yet emi Áll atkí serl eti Biz otts ág előírás ai szerint v égeztün k.
Pat kán y máj mi kr osz óma pr ep arál ása
A máj mik rosz ómák at Fl ei shn er és Krau s-Friedm ann 19 86 -os cikk éb en leí rtak szerint preparáltuk . Rövi den, Spragu e-Dawl e y pat kán yo k máj át jéghid eg, 0, 32 M szukrózt, 2 0 mM MOP S-pu ffert (p H 7 ,2 ), 0,5 m M EGTA-t , val amin t pro teáz-i n hibito rk én t 1mM ditio -treit olt (DTT) és 0,2 mM fenilm etilszu lfonil -fl uori dot (PMS F) t art alm azó old atb an ho mo genizáltuk , és 4 °C -on 20 00 g-vel 15 perci g cent ri fu gált uk. A felül úszót 15. 000 g -n 4 5 perci g, m ajd az íg y kel etk ezett felülú s zót 100. 000 g -n to váb bi 90 p erci g cent rifu gáltu k. Végül az össz eg yűjtöt t üled ék et 0 ,32 M s zukrózt , 20 mM MOPS-ot (pH=7 ,2), 1 mM DTT-t és 0 ,2 mM PMSF-et tart alm azó old at ban újra szuszpend áltu k. A fehérj eko ncent rációt m ind en alk al omm al Lo wr y-m ódsz errel hat ároztun k meg b ovin sz érum al bum int használv a szten derdk én t, és a prep arát um feh érj e k oncen trációj át kb . 2 0 m g/m l-re állít ottu k b e. A mint ák at fol yék on y nit ro génb en fag yaszt ottu k l e és a felh aszn ál ási g -8 0 °C -on t ároltuk .
A mi to kon driál is membrá n-pot en ciá l (∆ Ψm) mér és e
A ∆Ψm-et az en erg izált mitok ond riu mo kban felh almozó dó, katio nos safrani n-O fest ék fl uoresz cen cia-csö kk enés e al ap ján becs ült ük meg Akerm an és t ársai 197 6-os k özlem én ye n yo m án . 2 ml-n yi , 1 20 mM KCl-t , 20 mM Hepes-s avat , 10 m M káli um-fo szfátot , 1 mM M gCl2-ot, 0,0 05 mM EGTA-t, 5 mM kálium -gl utamátot, 5 m M k áliu m-mal átot , 0, 001 mM c yclos po rin A-t, 0,05 m M AP5A-t, 0 , 5 m g/ml BSA-t és 5 µ M safrani ne O-t (pH 6, 8 v ag y pH 7,8 ) t artal mazó ink u bál ó m édi umhoz 1 m g mito kon dri um -p rep arát umot adtun k és a s afranin O fluoresz cen ciáját Hit achi F-4 500 sp ekt roflu orimét erb en (Hit achi Hi gh Tech n olo gi es , M aid en head , UK), 5 Hz acquizí ciós rát áv al , 49 5 nm-es ex cit áci ós és 58 5 nm -es em issziós h ull ámho ssz on mértü k. A mérés ei nk et 37 °C-on v égeztük . A s afranin e O flu oresz cenci a milli volt ra (mV) t ört énő átv ált ásáh oz feszül tég– fluo reszcen ci a k ali bráció s gö rb ét vettün k fel . E cél ból safrani ne O flu oresz cenci át m értü nk 2 n M v alino m ycin jel enl ét éb en és a m édi um K+ ko ncent rációj át 0,2 – 1 20 m M tarto mán yb an lép és en ként emelt ü k. A m at rix K+ kon cent ráció ját 120 mM-n ak véve (Akerm an és társ ai, 1976 ) és a Nerst-egyen let et fel használ v a kiszámíth ató vá vált a ∆Ψm.
Izol ált mito ko ndr iumok C a2 +-fel vét elén ek mérése
Az inku báló m édiu m ból tö rt énő mi tok ond rium -d ep en dens C a2 +-kiv on ást a C a2 +-d ep en dens, memb rán -imp ermábil is fl uo reszcens fest ék, a C al ciu m Green (C aGreen, Molecu lar P rob es , Portl an d, OR, USA) 6K+-só jával köv ettü k. 2 ml -n yi , 0,125m g/ml mit ok ond rium ot, 12 0 mM KCl-t, 10 mM Tris t, 5 mM KH2PO4-ot, 1 mM M gCl2-ot (p H 7, 6) tart alm azó médi umhoz 500 nM C aGreen-t adtu n k, a szu bsztrát ok és eg yéb reagens ek h ozzáadás a a jel ölt időpo ntb an tö rtént és mi nd en m érés t 37 °C -o n v égez tünk. A fest ék fluo reszcenci a-int en zitás át Hit ach i F-45 00 fluo reszcen ci a spektrofotom ét erb en (To k yo , J apan) m értük 51 7 nm-es ex cit ációs és 53 5 nm - es emi ssziós hull ám h osszt h aszn ál va.
Mito ko ndri ális duz za dás mér ése
Iz ol ált mito kon dri u mok duzz ad ás át GBC UV/V IS 92 0 spektro- foto mét erb en, 52 0 n m hull ámh osszú fén y szó rásának vizs gál at áv al k öv ettü k.
120 m M KCl -t , 10 mM Trist, 5 m M KH2PO4-o t, 1 mM M g Cl2-ot t artalmazó , 7,6 -os pH-jú old at 2 ml -éhez 0,1 2 5 m g/ml v égső kon cent ráció b an mitoko nd rium ot ad tu nk, a szu bszt rát ok és eg yéb reagen sek ho zzáad ás a a j elöl t időpo ntb an t ört ént . Mind en m érés v égén a max im ális d uzzad ás k alib rál ás a céljából n em sz el ektí v, pó rus -formál ó p epti det, 40 µ g alam eti cin t haszn ált unk . Mi nd en kís érlet et 37 °C -on végeztü nk.
Mikros zómá k a ktí v t öltése Ca2 +-mal és Ca2 + f elsz aba dulá s mérése Ca2 + felv ét elt és k iáraml ás t 4 5Ca2 + izotóp s egíts égév el mértük . A mikroszóm ák at 15 0 mM KCl, 20 mM M OPS (p H 7, 2), 0, 5 m M M gCl2, 10 µ M Ca2 + tart almú old at b an hí gít ottu k, mi nd en kís érlet so rán 20-4 0 nCi 4 5CaCl2-ot haszn ált unk mérési ponto nk ént . A Ca2 + felv ét elt 1 mM ATP hozzáad ás áv al indítot tuk sz ob ahőmérsékl eten. C a2 + felsz ab adu lást 1 00 µ M EGTA hozzáad ás áv al i dézt ünk elő C a2 +-mo bil izáló ágen sek (10 µ M IP3, 10 µ M cADPR and 10 µ M NAADP ) jel en lét éb en, illetv e hián yáb an. A veziku lákb an ben tmaradó 4 5Ca2 + m enn yi s égét 0,5 ml mi kro szómát t art alm az ó old at 0, 45 µ m pórusn ag ys ágú , nit rocellul óz Millip ore filteren (HAWP) tört énő vákum - filt rál ás ával h at ározt uk meg. A filt erekt 5 ml quench old att al (150 mM KCl, 20 mM M OPS (p H 7,2), 10 m M M gC l2 és 1 mM LaCl3) mostuk a n em
speci fik us an kötődő rad io aktiv itás csö kk ent és e célj áb ól. A filt eren visszamaradt radi oak tivit ást szt en derd szcintill áci ós száml ál ás sal mértü k m eg.
Mikros zómá k p asszí v tölt és e és Ca2 + fel s zaba dulá s mérés e
Máj mik roszó mák 5 mM 4 5CaC l2-m al (2 0-4 0 nC i mérési p onton k ént ) val ó p asszív t ölt és éh ez 150 mM KCl , 20 mM MOPS (p H 7, 2), 4 5Ca2 + és 5 mM Ca2 + tart almú , j égh ideg m édiu mb an t ö rténő, mini mum 5 órán keresztüli inkub ál ást al kal mazt unk. A p asszí van tö ltött v ezikul ákat szo bahőm érs éklet en 10-szeresre h í gíto ttu k a 150 m M KCl -t , 2 0 mM M OPS-ot (pH 7,2 ) és 50 0 µ M EGTA-t t art alm azó Ca2 +-mo biliz áló medi umm al. Az al kalm azott EGTA men n yis éggel a pC a-t 6 -ra állít ottu k. A C a2 + ki áraml ást qu en ch -old att al tört énő 5-szörös hí gí táss al állít ottuk m eg , ezt kö vetően a mi n ták at Mill ipo re- filt erek en keresztül filtrátu k, 5 ml qu en ch -old att al m ostu k és a filt eren m aradt radio akti vit ást szten derd szci ntill ációs számol ás sal m ért ük m eg.
Eredmények és megbeszélés:
#1
A Cyclop hilin -D kompl ex sz er ep e az agy-sp ecifi kus , Ca2 +-ind ukált mito ko ndri ális permeab ilitás tr anzí ció ba nElsők ént a C aCl2 izolált ag yi mitok o ndri umo kra g yak o ro lt hat ás át teszt eltü k gl ut amát és m al át jelenlétében, ill et ve hi án yáb an és 52 0 nm-es hull ámho sszon fén ys zóród ást m értün k s p ekt ro fot ométer segít ségév el . Ebb en , és az ezt kö vető h aso nló kís érl etekb en u g yan azt a h áro m-l ép és es CaCl2
ad ago lási p rot okoll t haszn ált uk: a 1 00. máso dp ercben 20 µ M CaCl2-ot, maj d ezt kö vetően a 30 0. máso dp ercben és v égü l az 5 00. m ás od percben 20 0-200 µ M CaCl2-ot adtun k a mint áh oz. Az első, 20 µ M C aCl2 hozzáad ás a n em okozott a vad típu sú (WT) egerekből szárm azó ag yi mit okon dri umo kb an fén yszó rás -csök kenést sem a subszt ráto k jel enl ét éb en, s em azok hi án yáb an, han em ell en k ezőleg, a fén yszó ró d ás al apvon al án ak fo koz ato s cs ökk enés ének megszűn és ét észlelt ü k. Vi szont a kö vet k ező, 200 µ M -o s CaC l2 lökés hat ás ára a szub sztrát -hi án yo s mitoko nd rium ok fén yszó rása nag ym ért ékb en csök kent, ell ent étb en a sz ubsztrátt al ell átott mitoko ndriumo kéval . Az 500 . máso dp ercben adott köv etk ező 2 00 µ M CaCl2 h atására a sz ubsztrát -hi án yo s
mitoko nd rium ok fészórás a n em v álto zott, mí g a sz ubs ztrátt al ellátott mitoko nd rium ok fén ysz órás áb an ki sfokú v áltoz ást tapasztalt unk. Az el ső 20 0 µ M-os C aCl2-lök és h at ás a c ycl osp ori n A-érz ék e ys éget m ut atot t, de a m ás odik 200 µ M CaCl2 adás a a C ys A védő h at ását fel ülírta. A köv etkező kí sérl et ek során azt h aszn áltu k ki, ho g y c yclo phili n -D génkiüt ött egerek hozzáférh etőek volt ak. A szu bsztrát -hi án yo s C yp D-KO egerek ből szárm azó mitoko nd rium ok es et éb en m ért ad ato k feltűnő h as onl ós ágo t mut att ak a WT egerekből szárm azó és C ys A-v al k ezelt mitoko nd rium ok éiho z. A szubszt rátok j el enl ét e viszo nt nem jelent t ov ább i v éd elm et C yp D KO mit oko nd rium ok es et éb en . Ezen ered mén yeink azt mutat ják, ho g y n agy d ózisb an ado tt Ca2 + szubsztrát ok hián yáb an is k ép es PTP kivált ás ára. Kís érl et es kö rü lmén yei nk között a szubsztrát ok hi án ya megak ad ál yozz a a mitokon dri umok at abb an , ho g y -1 0 mV-nál nag yo b b m embránp ot en ci ált épít sen ek fel, amel y n em tesz lehetőv é jel entős mit oko n dri ális Ca2 +-felv ételt. En nek m egfelelően az ex tramito kon dri áli s Ca2 +-k on cent ráció C aGreen 5 N-n el v al ó köv et és eko r azt tap aszt altu k, h o g y szubsztrát ok hi án yá ban a mi tok ond riu mok n em v olt ak kép es ek C a2 +-ot sz ekvesztrálni , ellenb en jel entős fén yszó rási v ált ozás ok at mutat tak. A fén yszórási v ált ozást mutat ó mito kon dri umok el ekt ron - mikroszkó pos vizs g ál atával megerős ítet tük, h o g y a fén ysz órási v áltoz áso k hátt erében mit oko nd riális duzzad ás áll.
A célb ól, h o g y a Ca2 + t ám ad ási po ntj án ak h el yét m eghat ározzuk a fén yszó rási v álto zások ki v áltásáb an, a mito kon d rium ok at az ex tramito kon dri áli s Ca2 +-fel v ételt i gazol t módon gált ó ko ncentrációjú R u36 0- nal in kub ált uk és kimut attuk , ho g y Ru360 -n al k ezel t mitoko nd riumo k tov ább ra is mut att ak fén yszó rási v áltoz ások at n ag y dózisb an hozzáadott C a2 + hat ás ára. A Ru36 0 C ys A j el enl ét éb en s em ok ozott fén ys zó ródás-vál tozást és Ru360 m ell ett a Ca2 + WT és C yp D KO mitoko nd rium ok ra gyak orolt h at ás a is azono s v olt. A mito kond riu mok at telj es en d epol arizáló sz étk ap csol ósz er n em jel ent ett v éd elm et a nag y dózis ú Ca2 + okozta duzzad ás ellen , sőt a WT mitoko nd rium okb an még a szubszt rátok p rot ektí v h atását i s el lens úl yozt a. Azt a tén yt , h o g y az Ru360 n em n yú jt véd elm et a Ca2 +-i n duk ált jelentős fén yszó rási v ált ozás ell en azzal mag yarázzu k, ho g y a C a2 + ex tramito kon dri áli s kötőh el yen h at. Viszont , a m itok on dri ális m átrix b an ben tmaradó Fura 2 -v el tölt ött és szél es m ezejű epifl uo reszcen s mikroszkó pp al
vizs gált izolál t mitoko nd rium ok m egl epő módo n hatalm as Fu ra 2 fluo reszcenci a-nö vek ed ést m utat tak 0, 1 mM CaCl2 t art alm ú pufferrel tö rt énő perfúzió es et én . Ez a hatás cs ak részl eges Ru360 - (10 µ M ) és ruténium -v örös (10 µ M ) érz ék en ys é get m utat, ami azon fel tét el ezés el len s zól, ho g y a Ca2 + kizáról ag ex tramit o kond ri ális támadás pontt al rend el kezi k a fén ysz órási vált ozás ok kiv ált ás ában .
A k öv etk ezők ben a Kompl ex I. (rot eno n és pi ericidin A), a Kom pl ex III. (m yx oti azol és stigm at elli n) és a Kompl ex IV. (KC N) gátló szerein ek hat ás át vizs gált uk meghat ároz and ó azt, ho g y a légzési lánc mel y el em ei járuln ak hozzá a szubsztrát ok C a2 +-ind uk ált fén yszó rási vált ozások ra g yak o rolt p rot ek tív hat ás áh oz. A mérés eink al apj án az a k ép bont akozik ki , ho g y mí g a rot eno n és a p ieri cidi n A a szubsztrát ok j el enl ét étől , illetv e hián yától fü ggetl en ül megv édi k a mitoko nd rium ok at a C a2 +-in duk ált fén yszó rási v áltoz ásoktó l, ad di g a v éd elm et n em n yúj tó m yx oti azol , sti gm at ellin és KC N még a sz ubszt rát ok jótékon y h at ás át is ell ens úl yozz ák.
Viszont a Kom pl ex I.-et a rot eno nétól és a pi eri cid in A-étól el térő kötőh el yen blokk oló , m agas ko ncent ráci ójú m yx oti azol (10 µ M ) és sti gm at elli n (2 µ M ) sem jel en t v éd elm et.
A C ycl op hilin D i n situ, ag y-sp ecifiku s PTP megn yit ás áb an játszot t szerep ét vizs gál and ó , C yp D-defi ci ens és WT mitok ond riu mo k cal cim ycin (1 µ M 4Br-A2 318 7) o k ozta Ca2 +-túlt öltés s orán észlelt d uzzad ását h aso nlítot tuk össze u g yan azon s ejk ultú ráb an t al álh ató n eurono kb an és ast ro c yt ák ban mitoko nd ri ális an t argettál t DsR ed2 segíts égév el és szél es mez ejű epi flu oresz cencia-mi kro szkóp al att vizs gálva. A n eu ron ok at és az ast ro c yt ák at az elt érő mitok on dri ális mo rfoló gi áj uk al apj án k ülön ít ettü k el és a mitoko nd ri ális duzz ad ást az át lag mi to kond ri ális átm érők “thi nn ess rati o”
(v éko n ys ág-arán y) t echni kával tö rt énő kiszámí tás ával kö vettük. A duzzadás kezd et ét az előb b em lített “t hin ness rat io ” hi rt el en cs ökk en és év el d efini ált uk.
Mind a WT, mind a C yp D-KO n eu ro náli s mitok ond riu m ok duzzadtak és fragm entál ódt ak a cal cim ycin hozzáad ás áv al kiv áltot t Ca2 + túlt öltődés kezd et étől sz ámít ott 600 -80 0 másod percen b el ül. Amiko r gl ükózm ent es és 2 mM 2-dezox ygl ükóz tart alm ú médium ban a cal cim yci nn el eg yü tt NaC N-ot is alk alm aztun k, m ind a WT, min d a C yp D-KO mi tok ond ri umok duzzadás a szinte azo nn al b eköv etk ezet t. Viszo nt 1 µ M SF 68 47 -t el tö rt énő szét k ap csol ás
es et én a C yp D-KO neu ron áli s mitoko ndri umo k duzzad ás a szigni fi káns an koráb bi i dőp ontb an kezdődik , min t a WT neurono kéi. Azonb an a n eu ron okk al ell ent étb en a szétkapcs olt astro c yt a-mito kon dri umo k Ca2 + túlt ölt és re bek öv etk ező duzzadás a a W T ast ro cyt ák b an j el ent kezi k szi gni fik án san ham arabb, mint a C ypD-KO es et én.
Végül a cél ból , ho g y in situ n eu ron ális m itoko nd riumo k at eg y más fajta módszerrel lét rehoz ott magas Ca2 + t erhel ésn ek kit év e vi zsgálh as sun k, a neu ro nok at M g2 +-m entes kö rn yez etb en ex citot ox ikus szintű gl utam át és gli cin hat ás án ak vetett ük alá. A gl utamát bi fázi sos mit oko nd riális d uzzad ást v ált ott ki eg y k ezd eti elsőd leges és eg y jól elk ülönü lő, késői m áso dlagos “thi nn ess rat io ” eséss el. A “thi nn ess ratio ”-b an észl elt első esés köv etk ez etesen eg yeb ees ett a glut am át h atására ki al akult c yt opl azmat ikus [C a2 +]i-vál assz al és a más odik es és m indi g m egfel elt a máso dl ago s, irrev erzibilis [Ca2 +]i- em elk ed ésn ek , ami t “d el a yed cal ciu m deregul atio n ”-n ek (DC D) n ev ezün k. A C yp D-KO egér s ejt k ultú rákból szárm azó mint ák m ind össz e 6 0%-ában al akul t ki a neuron ális mi to kond riu mok elsődl eges d uzzad ás a és DC D so rán cs ak a neu ro nok 4 0%-áb an jel entk ez ett a máso dl ago s duzzad ás. Tov ább á a mitoko nd rium ok el sődl eges duzzadása s zignifi káns an k ésőb b jel ent kez ett a C yp D-KO n eu ron ok ban , mint a WT neu ron okb an , mí g a máso dlagos mitoko nd ri ális duzzad ás megjenéséi g el telt időben n em vol t st atisztik ail ag ért ékel hető külö nbs ég.
#2
Az NAADP-ind ukált Ca2 +-f elsz aba dul ás h epa to cyt a mikros zómákb an A p at kán ym áj mik roszóm áli s v ezik ul ák ATP j el enl ét éb en g yo rs ütem ben szekv eszt rálják a 4 5Ca2 +-ot, a Ca2 +-akk umul áció m ért éke 4,0 ± 0. 2 nmol/m g feh érj e (n=1 3). 5 -1 0 p erc elt elt év el m ax imáli s Ca2 +-felv ét el t det ekt ált unk és io no m yci n (5 µ M ) hat ás ára a m ik roszóm ák b an sp eci fi kus an fel h almozó dott C a2 + menn yi s ég 90 %-a g yo rsan kiü rült . A sz el ektív S ERCA- gátl ó t hapsi gargin (1 µ M ) a m ik roszóm ák Ca2 +-felv ét el ét m ajd nem t elj es en megszűnt ett e, mí g a V-tí pus ú ATP-áz blo kko ló b afilo m yci n A1 cs ak minim ális an befol yásol ja a m áj mi kro szómák C a2 +-h almozás át. Ezen ered mén yek fén yéb en a SERC A j átszik vez ető sz erepet a m áj mi kroszóm ák aktí v tö ltésében.Az NAADP (10 µ M), az IP3 (1 0 µ M) és a cADPR (1 0 µ M) gyo rs Ca2 + kiáraml ást i ndu kál m áj mi kroszóm ákt ól, mel yek szi gn ifi káns an kül önb özn ek a a kont rol lk ént h aszn ált Ca2 +-ind uk ált Ca2 +-kiáraml ás (C ICR ) menn ys iégétől.
A C a2 + ki áraml ás 5. másod percében a C ICR so rán felsz ab adul t C a2 + men n ysi ége 0, 165 ± 0,06 nm ol/m g fehérj e, az IP3 0,7 ± 0, 09 nmol/m g fehérj e men n yis égű Ca2 +-ot mobiliz ált, mí g a cADPR h at ás ára 0,8 2 1 ± 0, 1 nmo l/m g fehérj e C a2 + szab ad ult fel . Az onos kö rü lmén yek k özött az NAADP -in duk ált Ca2 +-fel szabadul ás mértéke 0,4 2 ± 0,0 8 nmol C a2 +/m g fehérj e. Teh át az NAADP pot ens , d e az IP3-nál és a cADPR-nál valam iv el kev és bé h atásos Ca2 +-mo biliz áló más odl agos hí rvi vő m áj mik roszóm ák ban. Az NAADP m áj mikroszóm ákb an d ózis-fü ggő mód on, 0,9 3 ± 0, 1 µ M-os félt elí tési kon cent ráció b an (EC5 0) hoz l ét re C a2 +-ki áraml ást . A köv etk ező lépésb en ATP regeneráló ren dszer jel enl ét éb en vizs gált uk az eg ym ást k öv etően alk alm azott IP3, cADPR és NAADP C a2 + mobiliz álását ak tív an töl tött m áj mikroszóm ákb an . Az NAADP a cADP R és az IP3 m egelőző alk alm azását köv etően is m ax imál is men n yis égű Ca2 + kiáraml ást ind uk ált, teh át az IP3, a cADPR és az NAADP között n em jön létre k ereszt -d eszenzitizáció. Ez en ered mén y m egerősí ti az a v él em én yt , h o g y m áj mi kroszóm ák ban az NAADP eg y, az IP3-ét ól és a cADPR -étól eltérő és fü ggetl en Ca2 +-mob ilizál ó útvon al ra h at . Az NAADP h omol ó g deszenzitiz áci ój án ak bemutat ás a célj áb ól az ak tív tö ltés 3. p ercéb en küszö b al att i (0, 1 µ M), önm agáb an j el entős Ca2 + kiáraml ást n em okoz ó NAADP -v el ink ub áltu k a mik roszóm ákat és 2 perccel később 10 µ M NAADP h at ására mi ndös s ze 0, 14 ± 0,0 4 nm ol/ mg feh érje Ca2 +- kiáraml ást d et ekt ált u nk, ö sszehason lítv a a n em előkez elt mi k roszóm ák ból 10 µ M NAADP adásakor fel szab aduló 0 , 39 ± 0,0 4 nmol Ca2 +/m g feh érje men n yis éggel . Teh át , az NAADP ö nm agán ak a sp eci fiku s antagoni stájaként viselk edik , 50 %-os gátl ási kon cent ráci ój a ( IC5 0) 3 0 nM. Az NAADP d ózis- hat ás gö rb éj e és a vált ozó kon cent ráci ójú NAADP-vel tö rt énő elői nku bál ás utáni telí tő dózis ban alk alm azott NAADP in duk ált a rezid uál is Ca2 + fel szabadul ás görbéi eg ym ást U al akb an metszik , t ekin tett el arra, h o g y az NAADP a saj át receptorait a félt elít ési kon cent ráció jánál egy n ag ys ágredd el kisebb 50 %-os gátlás i kon cent rációv al deszenzitiz álj a.
Amiko r az aktív an töltött mik ro szóm ák at bafilom yci n A1 -g yel legal ább 5 p ercen át előin kub áltu k, azt t al áltu k, h o g y m ind az NAADP (1 0 µ M ), mind
a cADPR (1 0 µ M) t eljes en n ormál is Ca2 +-ki áraml ás t eredm én yez ett. M ás felől a mik ro szóm ák th ap s igargi nn al (1 µ M ) tö rténő előkez el és e az NAADP -re és a cADPR-ra ad ott v álaszt hason ló mért ékb en csö kk ent ett e. Eredmén yein k al apj án a m ikroszó mák ból t ört énő C a2 + kiáraml ást a “o ne-po ol” mo dell el leh et l eí rni , t eh át a mikroszóm ák osztat l an C a2 + rak tárk ént fo gh ató ak fel. A mikroszóm ák a liz oszómák és az en dopl azmás reti kul u m kevered és éből szárm azt ath ató ak , elsőso rb an SERC A-n keresztül töltődn ek Ca2 +-mal és megt al álh at óak rajt u k az IP3, a cADPR és az NAADP recepto rai.
Ezt kö vetően bem u tatju k, ho g y az IP3- és a cADPR -m ed iált C a2 + kiáraml ás külső C a2 + kon cent ráció -fü gg ési gö rb éi h aran g-al akú ak , pCa=7 -re és 6 -ra esik a csú csu k, ezzel szemb en az NAADP által mobilizált C a2 + men n yis ége jó köz el ítéss el fü ggelt en az ex trav ezik ális Ca2 + kon cent ráció tól.
Tov ább á azt tal ált u k, ho g y az NAADP medi ált fol yam at ot az ink ub áló pufferold at pH-j án ak 6, 4 és 7, 8 k özötti tartom án yb an v aló vált oztat ás a n em befol yás olj a, el lentétben a cADPR hatásáv al, m el y 7, 2-es pH optim umm al jel entős p H-fü ggést mut at. Teh át az NAADP és a cADPR Ca2 + m obiliz áló hat ás át a p H elt érő módon b efol yásol t a, tov áb bi bizon yí t ékát adv a an n ak, ho g y ez en m ásod lag os hí rv ivők fun kci on ális an eltérő j elátvit eli útv on al részét kép ezik . Végül, az IP3 recepto r ant agoni stak én t ism ert h ep arin (1 00 µ g/ml ) cs ak az IP3-m edi ált Ca2 +-mo biliz áci ót gátolja, a cADPR-éra és az NAADP -éra nem h at. A r yan odi n-recept or antagon is ták (r yan odin [5 µ M] és ruth eni um- vörös [5 µ M]) cask a cADPR -in duk ált C a2 +-fel szab adul ást cs ökk ent ett ék , az IP3 és NAADP h atás át n em v ált oztat ták meg. Ezzel szemb en az L-típu sú C a2 + cs ato rn abl okk erk ént ismert v erap amil (10 0 µ M) és dilt iazem (1 00 µ M ) speci fik us an, de cs ak részlegesen gát olták az NAADP Ca2 + mobi lizál ó hat ás át, mí g az IP3- és cADPR -m ediált fol yam atok at cs ak minim ális mértékb en m ódo sítot ták . Ös szes ségében elmond hat ó, ho g y s em a h ep arin , s em a r yano din és ru t hen ium vörös nem gát olt a az NAADP-ind uk ált C a2 + fel szabadul ást, visz ont a verap amil és diltiaz em az NAADP recept orok hat áso s inhi bito rai, ami to vább erősíti azt az elk épzelést, h o g y az NAADP - medi ált C a2 +-felszabad ul ás m áj mik ro szómák b an is fü gg etl en és ö nál ló jel átvit eli útv on al.
Publikációs lista:
A dis sz ertá ci óho z ka pcs olód ó köz lemén yek
Mán di M. , Tóth B. , Timár G y. an d Bak J . (200 6): C a2 + rel ease t ri ggered b y NAADP in hepato c yt e mi cros omes.
Bio chem . J . 3 95: 233 -23 8.
[ IF: 4. 100 (200 6)]
Mán di M . & Bak J . (20 08 ): Ni cotin ic acid ad en in e n ucl eo ti de dipo hos ph at e (NAADP) and Ca2 + mobiliz atio n.
J . Recep t. Si gn al. Trans du ct. Res. 23 (3 ), 163 -1 84.
[ IF: 1. 540 (200 8)]
Chino poul os, C ., Vajda, S., Cs an ád y, L. , M ándi , M. , M áth é, K., and Ád ám - Vizi, V. (2 009 ): A n ovel kin eti c as sa y o f mito cho nd ri al ATP -ADP ex chan ge rat e medi ated b y t he ANT.
Bio ph ys .J . 9 6, 249 0-2504 . [ IF: 4. 683 (200 9)]
Vaj da, S., Mándi, M ., Konrád, C. , Kis s, G., Amb rus , A., Ád ám-Vizi , V. , and Chino poul os, C . (2 0 09): A re-ev alu atio n of th e rol e o f mat ri x acidi fi cation i n uncoup ler-ind uced C a2 + rel eas e from mit o cho nd ri a. FEBS J . 2 7 6, 2 713 -2 724 . [ IF: 3. 139 (200 9)]
Chino poul os, C ., Gerencsér, AA., M ándi , M., Mát h é, K., Tö rőcsik , B. , Dó czi, J ., Tu riák, L., Ki ss, G., Kon rád, Cs ., Vajd a, Sz. , Vereczk i, V., Oh , RJ . and Ád ám-Vizi, V. (2 01 0): Fo rward op erati on o f ad enin e n u cleotid e translo cas e duri n g F0 F1 -ATPas e rev ers al: crit ical ro le o f m at rix sub strat e-level phos pho r yl ati on. FASEB J . 24 (7), 2 405 -2416 .
[ IF: 7. 049 (200 9)]
Dó czi, J ., Tu riák, L., Vaj da Sz., M ándi, M., Tö rőcsi k, B., Geren cs ér, A.A., Kiss , G. , Ko nrád , Cs ., Ád ám -Vizi, V., an d Chino pou los, C . (2011 ): Co mpl ex con tri buti on o f C yc lophili n-D to Ca2 +-indu ced p ermeabilit y t rans ition in brain mito ch ond ri a, with rel atio n to th e b ioenergeti c s tat e.
J . Bio l. C hem . 2 86 (8), 63 45 -63 53.
[ IF: 5. 52 (2 009 )]
A dis sz ertá ci óho z n em kap cs olód ó köz lemén yek
Kon rád, C s.; Kiss, G.; Törőcsik, B.; Lá bár, J .; Gerencsér, A.A.; M án di, M .;
Ád ám-Vizi, V. , and Chino poul os, C. (2011 ): A di stin ct s equ en ce i n th e ad eni ne nu cl eoti de transl ocas e from Art emi a fran ci scan a emb r yo s is ass oci at ed with ins ensitivi t y to bon gk rekat e and at yp i cal effects of adenin e nucleotid es on Ca2 + upt ak e and s equ est ration. FEBS J . 278 (5 ), 822 -8 36.
[ IF: 3. 139 (200 9)]
