KapcsoltságHomológ rekombináció

Általános Genetika

Kapcsoltság

Homológ rekombináció

Az eukarióta kromoszóma térképezés

alapjai

Egyezményes genetikai jelölések

gének azonos kromoszómán:

pr vg pr+ vg+

pr vg

pr+ vg+ = = pr vg / + +

= ^{pr vg / pr}

^vg

gének különböző kromoszómán:

w vg

w+ vg+ = ^{w vg} _{w+ vg+} = ^{w / w}

^{; vg / vg}

= w / + ; vg / +

Szagos bükköny

pollen alakja: L– hosszúkás vagy ll kerek

P PP LL X pp ll

F1 Pp Ll

F2 Fenotípus észlelt

várt

lila, hosszú (P- L-) 284 > 215 lila, kerek (P- ll) 21 < 71 piros, hosszú (pp L-) 21 < 71 piros, kerek (pp ll) 55 > 24

összesen: 381 381

Feltételezték, hogy e megoszlás oka az, hogy a domináns allél

„kötődik” (coupling) a dominánshoz, míg a recesszív a recesszívhez

W. Bateson és R.C. Punnett kísérlete és eredményei (1911)

4

Morgan Drosophila kísérletei

Thomas Hunt Morgan és Alfred H. Sturtevant

a „légyszobá”-ban

Morgan Drosophila kísérlete I.

szemszín: pr

és pr

szárnyhossz: vg

és vg

P prpr vgvg nőstény x pr

pr

vg

vg

hím

F1 prpr

vgvg

nőstény x prpr vgvg hím

F2 fenotípusa: pr

vg

1339

(>F1 nőstények gamétái, 1:1:1:1-t várnánk)

pr

vg 151 pr vg

154

pr vg 1195

összesen: 2839

(test cross)

6

Morgan Drosophila kísérlete II.

(testcross)

Felcserélt allélkombináció

P pr

pr

vgvg nőstény x prpr vg

vg

hím

F1 pr

pr vg

vg nőstény x prpr vgvg hím

Utódok pr

vg

157

pr vg 146

pr

vg 965

pr vg

1067

összesen: 2335

 nem a domonáns allél vonzza a dominánsat, ill. a recesszív a recesszívet,

} ^1:1

} ^1:1

Hogyan keletkeznek a nem szülői (rekombináns) ivarsejtek kapcsolt gének esetén?

Azonos kromoszómán levő allélpárok kapcsolt öröklődése

Ez igaz a felcserélt allélkombinációra is, pl.

pr pr vg+vg+ x pr+pr+ vg vg Vezessük le!

> Kapcsolt gének esetén az eredeti (szülői) allélkombináció a vártnál nagyobb gyakorisággal lesz jelen az ivarsejtekben

Az átkereszteződés a nem testvér kromatidák között történik a meiózis I. profázisában

Intrakromoszómális vagy Homológ rekombináció

Olyan haploid génkombináció létrejötte a meiózis során, amely különbözik a (meiotikus

diploidot létrehozó) haploid szülői génkombinációtól.

Rekombináció:

Mendel dihibrid keresztezéseiben is történt rekombináció

Rr Yy x rr yy (tesztelő keresztezés)

gaméták: RY Ry rY ry ry

Arányok: 1 : 1 : 1 : 1

rekombináns Szülői genotípus rekombináns

2 féle rekombináció van

RrYy Rryy rrYy rryy RR yy x rr YY

P

F1

Interkromoszómális rekombináció

50%

50%

Intrakromoszómális rekombináció

Intrakromoszómális rekombináció esetén a rekombinánsok aránya rendszerint

kevesebb, mint 50 %

Ennek oka, hogy a két vizsgált lókusz között nem történik átkereszteződés minden meiózisban

50%

50%

Ez sok utód (sok meiózis) végkimenetele!

Ha A és B lókuszok azonos kromoszómán kapcsoltan találhatók, akkor a két lókuszra nézve rekombináns ivarsejtek 50%-nál kisebb arányban keletkeznek a

dihibridben ¹⁴

Hogyan mérhető a rekombináció a diploidokban?

A diploidok rekombináns termékeit legkönnyebben a heterozigótáknak recesszív tesztelő törzshöz való keresztezésével azonosíthatjuk.

Hogyan mérhető a rekombináció a haploidokban?

A homológ rekombináció mechanizmusa

A homológ DNS-molekulák között történő rekombinációt homológ rekombinációnak nevezzük

(most a meiotikus hom.rek-val foglalkozunk, de ez a mechanizmus nemcsak meiózisban, hanem vírus és prokarióta genomok keveredésében, DNS-hibajavításban is fontos).

A homológ rekombináció nagyon pontos folyamat: genetikai információ nem vész el, és nem keletkezik.

A rekombináció kromoszómatöréssel és újraegyesüléssel valósul meg.

A kromoszóma szakaszok fizikai cseréjét több bizonyíték is alátámasztja:

- Kukorica (Barbara McClintock és Harriet Creighton, 1931)

- Escherichia coli  fágja

Kettős heterozigóta meiózisa

Test cross

A rekombináns

utódok kromoszómái (+ a tesztelő szülő homológja, amit ez az ábra nem mutat) vagy

A törés–újraegyesítés kísérletes bizonyítása  fággal

(Matthew Meselson és Jean Weigle 1961)

A c mi mutáns törzs ¹³C és ¹⁵N tartalmú nehéz DNS-t, a vad típus könnyű DNS-t tartalmaz.

Kettős fertőzés után az utód fágok Cs Cl sűrűség grádiensen a könnyű és nehéz sávok között köztes sűrűségű sávok is megjelennek, melyek rekombináns kromoszómákra utalnak.

A c mi+ rekombinánsok valójában a nehéz sávhoz közeli átmeneti zónában találhatók, mivel a markerek az egyik kromoszóma véghez közel esnek.

A tömlősgombák (Ascomycota) meiózis termékei közvetlenül vizsgálhatók. Ezt nevezzük tetrádanalízisnek.

A tetrádanalízisekből (Neurospora crassa) alapvető ismeretek származnak az intrakromoszómális rekombinációval kapcsolatban

A

a

Neurospora crassa - Ascomycoták közé tartozik.

ascus = spórák + őket körülzáró "zsák"

A spórák lineáris elrendeződésben vannak - a zsák megakadályozza a keveredést

A tetrádanalízisekből (Neurospora crassa) alapvető ismeretek származnak az intrakromoszómális rekombinációval kapcsolatban

pl. AB x ab

Meiocyta: AaBb

Tetrád (oktád egyszerűsítve) típusok:

1. AB 1. AB 1. Ab

2. AB 2. Ab 2. Ab

3. ab 3. aB 3. aB

4. ab 4. ab 4. aB

A B

x

A B

a b

Meiózis I. profázis tetrád

(2-2 kromatidás homológ pár)

vagy

A crossing over a 4- kromatidás állapotban történik, két nemtestvér kromatida között

A B

a b

A B

a b

vagy

Mind a 4 kromatida átkereszteződhet

(4 kromatidás kétszeres cr.o., lsd. néhány diával később)

Nem volt cr.o.

(vagy páros számú cr.o.

volt ugyanazon két kromatida között, lsd.

néhány diával később)

²²

Több crossing over történhet a kromatidák mentén, melyek összességében érinthetnek 3 vagy 4 kromatidát is (3 lókusz együttes vizsgálatából lehetett erre következtetni ABC x abc):

A crossing over a 4-kromatidás állapotban (nem a DNS-replikáció előtt, hanem után) történik, két nemtestvér kromatida között.

Ezt az támasztja alá, hogy két lókuszt vizsgálva egyetlen meiózis termékei négyféle allélkombinációval rendelkezhetnek:

Ha egy meiózis során NINCS crossing over, akkor nem képződik rekombináns kromatida/leánysejt Ha két lókusz között egy vagy több crossing over történik, akkor a meiotikus termékeknek átlagosan a fele rekombináns

A rekombináció Holliday-féle modellje (Robin Holliday 1964)

A Holliday modell a rekombinációban résztvevő két nem-testvér kromatida sorsát írja le. Ábrázolásában ezen két kromatidát alkotó DNS kettős spirálok egyes DNS szálai szerepelnek, azok irányultságának feltüntetésével mint

egyenes vonalak. A spirálok úgy fekszenek egymás mellett, hogy az első spirál alsó szálának polaritása ugyanaz, mint a második spirál felső száláénak.

marker gének

Szekvencia polimorfizmus a génkonverzió követése szempontjából fontos

A Holliday szerkezet kialakulása (a) kiindulási állapot

(b) Két parallel szálon bemetszés

történik. RecBCD + RecA.

A RecBCD fehérjék szerepe a széttekerés és hasítás

A rekombináció kezdő lépése a DNS hasítása és a DNS duplex

széttekerése. A széttekerést a helikáz és nukleáz aktivitással rendelkező RecB, RecC és RecD fehérjék komplexe végzi. A komplex ATP-t igényel az előrehaladáshoz.

A RecBCD komplex egy nyolc-tagú sorrendet ismer fel: 5’ GCTGGTGG 3’, amit chi helynek neveznek, és ami átlagosan 64 kb-onként fordul elő.

A keletkező egyes szálak

rekombinációt kezdeményezhetnek.

Az RecA fehérje stabilizálja a

keletkező egyes szálakat, és segíti az egyszálú DNS invazív viselkedését.

c) A szabad végek kapcsolatot

létesítenek a homológ kettős spirál megfelelő szálával. RecA.

d) A ligálás egy kereszthidat hoz létre a két DNS egyes szál között.

Ezt a DNS szerkezetet Holliday szerkezetnek vagy Holliday keresztnek hívják.

Kereszthíd vándorlás (branch migration)

Az átkereszteződési pont elmozdulásra képes. A kereszthíd vándorlás során a két homológ szál részleges különbözősége miatt össze nem illő

a Holliday kereszt

A kereszthídhoz beköt a RuvA fehérje tetramerje, majd ehhez két RuvB kapcsolódik. Ezek mozgatják a kereszthidat. Végül RuvC leszorítja ezeket, hogy elvágja, „megoldja” a kereszthidat.

A Holliday szerkezet feloldódása

A Holliday szerkezet feloldódása

A Holliday kereszt megoldódása megértését segítő ábrázolás. A Holliday szerkezet izomerizációja.

A Holliday szerkezet feloldódása

1., Ha az átkereszteződött egyes szálak vágódnak el, akkor a széli A és B markerek között nem jön létre rekombináció, csupán egy rövid heteroduplex marad a szál-elcsúszás helyén.

2., Ha az átkereszteződésben részt nem vett szálak vágódnak el, akkor rekombináció

történik A és B között, de a rövid heteroduplex szakasz ez esetben is megmarad.

1., 2.,

A heteroduplex a kettős szálú törés pontjától a a megoldódási pontig tart

A Meselson-Radding-féle rekombinációs modell

(a) Az egyik kettős spirál egyik láncában bemetszés történik. (b) A DNS polimeráz szintézisbe kezd, így egy szabad szál keletkezik. (c) A reaktív egyes szál a nemtestvér kromatida komplementer szálával párosodik, és eközben kihurkolja annak másik szálát (D loop). (d) A kihurkolódó szál enzimatikusan lebomlik. (e) Ligálás hatására előáll a Holliday kereszt, ami aszimmetrikus, mivel a pöttyözött szakasz nem heteroduplex.

Élesztő kísérletek arra utaltak, hogy a

heteroduplex nem szimmetrikus. Ez a modell módosításához vezetett. A magyarázó modellt Meselson és Redding javasolta.

34

Szostak féle rekombinációs modell

Kétszálú törés váltja ki a folyamatot

Nukleázok

visszaemésztik az 5’

végeket, 3’ túlnyúló végek keletkeznek.

3’ vég invazív

támadása D hurkot generál.

DNS polimeráz feltölti a hiányzó

szakaszokat.

A c

a C

Rekombináns termékek

A két kereszthíd

négyféleképpen oldódhat meg.

Summary of the current model for reciprocal

recombination according the double Holliday junction model for DSBR. For simplicity, one (two-stranded) sister chromatid of each homologous chromosome is shown (one homolog is green; the other is orange). A DSB event in the orange chromatid results in a nick that is further processed to reveal 3′-overhangs that can then invade the opposing chromatid homolog, resulting in strand displacement. DNA synthesis at the 3′-end of the invading strand, followed by second-end capture, concurrent with DNA synthesis to restore the

noninvading strand, results in the formation of a mature double Holliday junction as shown. This may then be resolved by the elusive meiotic “resolvase” in a number of permutations (A–D), resulting in the formation of crossovers (cutting at positions A or B) or

noncrossovers (cutting at positions C and D). A second mechanism for resolving the DSB event, known as SDSA, involves the first three steps as in this cartoon, but the mature D loop never forms. Instead, the D loop is rejected, resected ends are resolved by limited DNA synthesis, and the structure results in noncrossover events. Gene names provided to the left of each cartoon are indicative of putative regulators of the corresponding events. Model is based primarily on extensive yeast studies, but also on data from mice.

Genetic Analysis of Chromosome Pairing,

Recombination, and Cell Cycle Control during First Meiotic Prophase in Mammals

Endocrine Reviews June 1, 2006 vol. 27 no. 4 398-426

A meiotikus crossing over – a fontosabb megállapítások áttekintése Meiózis I. profázisban

Homológok párosodásakor: tetrád (2+2 kromatida – 4 DNS kettős hélix, melyek közül egy ponton 2 nemtestvér kromatida, azaz két kettős hélix vesz részt egy crossing overben)

Mind a négy kromatida részt vehet crossing overben, de egy ponton kettő kereszteződik át

Az átkereszteződést iniciálja: meghatározott DNS-szekvencia rész (chi hely), egyes vagy kettős szálú DNS-törés

Az átkereszteződés és a megoldódás helye nem feltétlen esik egybe (szálvándorlás)

Két lókusz közötti átkereszteződés nem vezet minden esetben rekombinációhoz (a megoldódás módjától függ)

Azokban a meiózisokban, amelyekben van crossing over két lókusz között, és a megoldódás rekombináns termékeket eredményez, az összes meiotikus

terméknek a fele rekombináns ₃₇

A kapcsoltság és a

rekombinációs frekvencia felhasználása géntérképek

szerkesztésére

Az eukarióta kromoszóma térképezés

alapjai

A rekombinációs gyakoriság

(=RF vagy rekombinációs frekvencia) számítása

Morgan kísérletében az F2 fenotípusos megoszlása:

Szülői kategóriák: pr

vg

1339

pr vg 1195

Rekombináns kategóriák: pr

vg 151 pr vg

154 összesen: 2839 Rekombinánsok száma: 151+154=305

Összes utód száma: 2839

Rekombinációs gyakoriság: rekombináns utódok száma osztva az összes utód számával.

305

Az átkereszteződés valószínűsége távolságfüggő

Minél távolabb van két gén a kromoszómán, annál nagyobb valószínűséggel

játszódik le átkereszteződés közöttük a meiózisok során. ⁴⁰

Géntérkép

• A rekombinációs frekvenciát mérve a gének közötti relatív távolságra következtethetünk.

• Egy géntérkép egység (map unit, rövidítve m.u.) az a génpárok közötti távolság, amikor 100 meiotikus termékből 1 rekombináns

• Másképp, 0,01 (vagy 1%) rekombinációs gyakoriság (recombinant frequency - RF) egyenlő 1 térképegységgel, melyet T.H. Morgan tiszteletére centimorgannak (cM) is neveznek.

• A m.u. NEM egy precíz fizikai mértékegység (nem feleltethető meg egyértelműen egy meghatározott bázispárban kifejezett távolsággal, az egyes biológiai rendszerekben a m.u.-ban és a bázispárban

kifejezett távolságok különböznek, akár egy genomon belül is)

• Lókuszok egymáshoz viszonyított helyzetének és relatív

távolságuknak a meghatározására azonban abszolút alkalmas módszer a rekombinációs térképezés

A térképtávolságok additívak

Mivel a térképtávolságok additívak, A-B és A-C távolsága két lehetőséget ad B-C távolságára nézve.

A géntérképezés lépései (kétpontos)

1., Tiszta vonalak keresztezése

P pr

pr

vgvg nőstény x prpr vg

vg

hím 2., F1 tesztkeresztezése

pr

pr vg

vg nőstény x prpr vgvg hím 3., F2 utódok számolása

pr

vg

157

pr vg 146

pr

vg 965

pr vg

1067

összesen: 2335

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

P +/+, cv/cv, ct/ct x v/v, +/+, +/+ Figyelem! A génsorrend ismeretlen!

F1 v/+, cv/+, ct/+ x v/v, cv/cv, ct/ct (testcross)

F2 v + + 580

+ cv ct 592

v cv + 45

+ + ct 40

v cv ct 89

+ + + 94

v + ct 3

+ cv + 5

összesen: 1448

szülői

rekombinánsok

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

P +/+, cv/cv, ct/ct x v/v, +/+, +/+

F1 v/+, cv/+, ct/+ x v/v, cv/cv, ct/ct (testcross)

F2 v + + 580

+ cv ct 592

v cv + 45

+ + ct 40

v cv ct 89

+ + + 94

v + ct 3

+ cv + 5

összesen: 1448

génpáronként külön-külön számoljuk az RF értékeket:

v - cv viszonylatában pl:

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

P +/+, cv/cv, ct/ct x v/v, +/+, +/+

F1 v/+, cv/+, ct/+ x v/v, cv/cv, ct/ct

F2 v + + 580

+ cv ct 592

v cv + 45

+ + ct 40

v cv ct 89

+ + + 94

v + ct 3

+ cv + 5

összesen: 1448 v - ct viszonylatában:

Szülői kombinációk: +, ct és v, +

rekombinánsok: v, ct és +, + = 89+94+3+5=191 RF = 191/1448 = 13,2% v-ct távolság = 13,2 cM

génpáronként külön-külön számoljuk az RF értékeket:

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

P +/+, cv/cv, ct/ct x v/v, +/+, +/+

F1 v/+, cv/+, ct/+ x v/v, cv/cv, ct/ct

F2 v + + 580

+ cv ct 592

v cv + 45

+ + ct 40

v cv ct 89

+ + + 94

v + ct 3

+ cv + 5

összesen: 1448 cv - ct viszonylatában:

génpáronként külön-külön számoljuk az RF értékeket:

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

Rekombinációs analízis:

Szülői kombinációk: + cv ct és v + +

cv – v viszonylatában rekombináns v cv és + +: 45+40+89+94=268 RF = 268/1448 = 18,5%

v – ct viszonylatában rekombináns v ct és + +: 89+94+3+5=191

RF = 191/1448 = 13,2%

ct – cv viszonylatában cv + és + ct: 45+40+3+5=93 RF = 93/1448 = 6,4%

v ct cv

13,2 cM 6,4 cM

18,5 cM

A génsorrend tehát: v - ct - cv,

(eredetileg hibás sorrendben v-cv-ct, írtuk fel)

Hárompontos térképezés

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny

Rekombinációs analízis:

Szülői kombinációk: + cv ct és v + +

cv – v viszonylatában rekombináns v cv és + +: 45+40+89+94=268 RF = 268/1448 = 18,5%

v – ct viszonylatában rekombináns v ct és + +: 89+94+3+5=191

RF = 191/1448 = 13,2%

ct – cv viszonylatában cv + és + ct: 45+40+3+5=93

v ct cv

13,2 cM 6,4 cM

18,5 cM

13,2 + 6,4 = 19,6 = 18,5

?

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny P +/+, ct/ct, cv/cv x v/v, +/+, +/+

F1 v/+, ct/+, cv/+ x v/v, ct/ct, cv/cv

F2 v + + 580

+ ct cv 592

v + cv 45

+ ct + 40

v ct cv 89

+ + + 94

v ct + 3

+ + cv 5

összesen: 1448

Rekombinációs analízis:

Szülői kombinációk: + ct cv és v + +

cv – v viszonylatában rekombináns v cv és + +

v + +

+ ct cv

Hol történtek rekombinációs események a kromoszóma mentén?

Drosophila tulajdonságok: v-sötét szem, cv-keresztvéna hiány, ct-lecsípett szárny P +/+, ct/ct, cv/cv x v/v, +/+, +/+

F1 v/+, ct/+, cv/+ x v/v, ct/ct, cv/cv

F2 v + + 580

+ ct cv 592

v + cv 45

+ ct + 40

v ct cv 89

+ + + 94

v ct + 3

+ + cv 5

összesen: 1448

Rekombinációs analízis:

Szülői kombinációk: + ct cv és v + +

cv – v viszonylatában rekombináns v cv és + +

v ct +

+ + cv

Hol történtek rekombinációs események a kromoszóma mentén?

A kettős rekombináció nem mindig észlelhető genetikai módszerekkel

A kettős átkereszteződés olyan rekombináns kromatidokat eredményez, melyek allél elrendeződése a két szélső gént tekintve megegyezik a

szülői elrendeződéssel.

A nagy távolságot átfedő kétpontos térképzéssel nyert adatok pontatlanabbul becsülik a valós térképtávolságot, mint a 3 pontos adatok, mivel a többszörös

Tanulságok

v ct cv

13,2 cM 6,4 cM

19,6 cM

v cv

18,5 cM

A térképtávolsággal ténylegesen a gének közé eső átkereszteződések (crossing overek) átlagos száma arányos.

Mivel arányos a térképtávolság?

RF =

=

összes utódok száma

Az RF azonban pontatlan mérőszám.

A térképtávolságot a rekombinációs gyakorisággal (RF) mérjük.

Kis géntávolság esetén a két szám közel azonos: az RF érték tükrözi a cr.o-k előfordulását Nagy géntávolságnál a crossoverek száma jelentősen nagyobb, mint a rekombinánsok száma.

A kétpontos térkép kis géntávolságnál pontos

A kétpontos térképezés adatai ezért kis géntávolságok esetén pontosak, megbízhatóak.

A B

a b

2 közeli lókusz között lejátszódó átkereszteződés esélye kicsi, a többszörös átkereszteződések valószínűsége pedig szinte elhanyagolható

Két lókusz közötti nagy távolság esetén a többszörös átkereszteződések biztosan bekövetkeznek.

A többszörös crossover a vizsgált markergének szempontjából

átlagosan 50% rekombináns terméket eredményez, ami a nem kapcsolt génekre jellemző.

A A a

a

B B

A kétpontos térkép nagyon nagy géntávolság esetén nem

mutat kapcsoltságot

Azonos kromoszómán egymástól távol elhelyezkedő

mendeli lókuszok nem mutattak kapcsoltságot.

A két függvény kis távolságok esetén egybeesik. A pontos térképtávolságok mérésének egyik megoldása a lehető legkisebb szakaszokkal történő

térképezés. Ez azonban nehézkes, munkaigényes, és egy sor élőlény esetén nem lehetséges.

(A térképfüggvény = a kék görbe függvénye).

m ér t tá vo ls ág ( R F ) m ér t tá vo ls ág ( R F )

valódi térképtávolság valódi térképtávolság

50

rövid szakaszokon mért távolságok összege

közvetlenül mért távolság

A kétpontos térképezés térképfüggvénnyel pontosítható

30

45

%

A B C D E F G H I J K

8 10 4 7 12 11 6 10 15 10

93 cM

A K

Egy kromoszóma rendszerint több mint 50 cM hosszúságú.

A Drosophila melanogaster korai géntérképe

A paradicsom kapcsoltsági térképe (1952)

A genetikai (kapcsoltsági) és a fizikai (DNS-szekvencia) térképek

összeegyeztetése

Térképezni nemcsak fenotípusos, hanem molekuláris

markerekkel is lehet

A klasszikus kapcsoltsági adatok és a DNS-

szekvencia ismeretének tükrében egérben ebben a régióban 1 cM ≈ 3000 kbp- nak felel meg. A gének mérete átlagosan 10–20 kbp közé esik (intronokkal együtt), a maradék

távolságokat az

intergénikus (gének közötti) régiók teszik ki.